Mycoplasma hyorhinis: 세포 배양 배지의 잠재적 공정 오염원
Mycoplasma hyorhinis란 무엇입니까??
마이코플라스마는 몰리쿠테스강에 속하는 그람 음성 박테리아의 속입니다. 몰리쿠테스강에는 마이코플라스마와 아콜레플라스마가 포함됩니다. 몰리쿠테스강에 속하는 세균은 세포벽이 없고, 매우 작으며(200-300 nm), 게놈이 매우 작습니다. 몰리쿠테스강 세균은 생존하기 위한 효소의 대부분을 만들어낼 수 없기 때문에, 진핵세포에 기생해 살아갑니다. Mycoplasma hyorhinis는 주로 돼지, 그리고 아주 간혹 인간의 피부(피부경화증과 연관되는 경우)와 관련지어져 왔습니다. 이 세균은 유행성 폐렴과 돼지생식기호흡기증후군(PRRS)와 같은 몇몇 돼지의 질병과 연관되어 있습니다.
자연에서 널리 보이기 때문에 이 세균은 모든 세포 배양 배지 종류에 대한 흔한 세포 배양 배지 오염원으로 취급받아 왔습니다. 가장 흔한(95%) 5개의 세포 배양 배지 오염원은 다음으로 판명되었습니다. Mycoplasma orale, Mycoplasma arginini, Mycoplasma hyorinis, Mycoplasma fermentans, Acholeplasma laidlawii, 그리고 Mycoplasma hominis 1.
세포벽이 없는 몰리쿠테스강 세균의 작은 크기와 유동적인 구조는 다른 미생물 종류를 억제하는 데는 적합한 통제 방법을 피할 수 있도록 해 줍니다.
몰리쿠테스강 세균은 세포벽이 없어 고압 조건에서 0.1 mm 필터를 포함한 멸균 필터를 투과할 수 있습니다. 멸균 필터를 통과하는 매우 적은 수의 세균은 제조 후 검사에서 오염이 검출되지 않을 확률을 증가시킵니다. (Windsor, Windsor and Noordergraaf).
이 기사는 Mycoplasma hyorhinis의 특징(다른 마이코플라스마와 공유하는 것이 많은)에 대한 개요를 제공하고, 이 세균을 적절히 검출하고 통제할 수 있도록 사용할 수 있는 조치를 권장하는 것을 목표로 합니다.
Mycoplasma hyorhinis는 왜 잠재적인 공정 오염원이 됩니까?
Mycoplasma hyorhinis는 특히 소 혈청과 trypticase soy broth를 포함하는 세포 배양의 가루형 첨가제와 같은 자연에서 유래한 원재료에 존재할 수 있습니다. 마이코플라스마 배지에서의 Mycoplasma hyorhinis의 성장은 이 세균의 성장에는 아주 적은 양의 영양 요구조건이 필요하다는 사실을 시사합니다. 제조 공정에서 필터 멸균(열 멸균과 비교했을 때)의 사용이 증가한 것은 Acholeplasma laidlawii 오염 사례가 증가한 것과 관련이 있는 것으로 간주되어 왔습니다.
마이코플라스마와 아콜레플라스마 오염 사례는 세포 배양체를 변질시킬 수 있으며, 이에 따라 변형된 세포 부산물, 심지어는 제구실을 하지 못하는 바이오 의약품을 얻게 될 가능성이 생겨납니다.
세포 배양 배지에서 Mycoplasma hyorhinis를 방지하는 방법은 무엇입니까??
Mycoplasma hyorhinis를 포함한 마이코플라스마가 세포 배양을 시행할 때 유의미한 비율로 존재하며 모든 세포 공정에서의 오염률 추정치는 대략 15-35%입니다.2
마이코플라스마는 혈청을 사용하지 않는 배지에서는 보다 드물게 발견 되었습니다3, 4. 따라서, 가능하다면 혈청을 사용하지 않는 배지를 선택하는 것이 좋겠습니다. 추가적인 예방조치에는 배지에 포함된 가루의 재구성에 필터 처리 대신 열 멸균한 물을 사용하는 것 등이 있습니다. Laidlaw와 Elford는 마이코플라스마 군집이 55°C의 온도를 5분 이상 견디지 못하며, 45°C에서 15분 경과 후 그 수가 유의미하게 감소한다는 사실을 발견했습니다. Windsor, Windsor, and Noordergraaf는 Acholeplasma laidlawii의 생존수가 50°C와 60°C에서 20분 이후 0으로 감소하지만 40°C에서는 그렇지 못하다는 결과를 확인하였습니다. 동일한 연구자들을 인용하면, “…아직은 어떻게 A. laidlawii가 배지 파우더로 유입되는지, 그리고 유사한 배지 파우더(펩톤 혹은 알부민)들만이 배지(혈청을 포함하지 않는)의 잠재적인 오염원인지의 여부는 알려져 있지 않다.” 또한, “이 균이 멸균 필터를 통과하고 이후 일반적인 펩톤 배지나 냉장 온도에 보관된 세포 배양 배지 용액에서 고농도로 생장할 수 있는 능력은 바이오 의약품 산업에서 심각한 의미를 가진다.”고 합니다.
제약업계에서 Mycoplasma hyorhinis의 존재를 확인하는 방법은 무엇입니까??
제약 환경에서 이러한 오염원을 검사하는 것은 규제기관의 보편적인 요구사항입니다. 이러한 검사에 대한 지침은 미국약전(USP) <63>장 마이코플라스마 검사, 유럽약전(EP) 2.6.7장 마이코플라스마, FDA 1993 고려할 사항(PTC), 그리고 미국연방규정집 21 CFR 610.30 마이코플라스마 검사에 수록되어 있습니다.
Mycoplasma hyorhinis와 같은 마이코플라스마형 오염원은 맨눈으로 보이지 않으며 심지어는 고농도에서도 광학현미경을 사용할 때 관측되지 않기 때문에 놓치기 쉽습니다. 배양한 세포들이 오염되지 않았다는 것, 그리고 이후 배치가 기존의 오염된 배치에 의해 추가적으로 감염되지 않도록 확실히 하기 위해 정기적인 검사가 필요합니다. 검출 방법에는 한천/배지에서의 직접 배양, 특정 DNA 염색, PCR, ELISA, RNA 라벨링 및 효소법 등이 있습니다.
시중에서 마이코플라스마 전반의 검출에 사용할 수 있는 여러 기술들이 존재하며, 각 기술마다 장단점이 존재합니다. 장점에는 넓은 범위의 몰리쿠테스강에 대한 검출능력과 검출하는 각 종에 대한 특이도가 있습니다. 낮은 위양성률 또한 중요합니다. 상대적으로 뒤떨어지는 방법에서는 위양성이 관측되며, 시간 및 노동력이 많이 들고, 원하는 특이도를 가지지 못합니다.
Mycoplasma hyorhinis 5와 기타 몰리쿠테스강 세균에 대한 완전한 게놈 염기서열 분석이 이루어졌기 때문에 PCR 프로브는 해당 세균을 빠르고 특이적으로 검출할 수 있습니다. 새로운 BioFire® Mycoplasma panel for mycoplasma detection에는 M. hyorhinis와 기타 다양한 몰리쿠테스강 세균에 대한 프라이머가 제공됩니다. 샘플의 준비와 검사의 시행은 간단하고 자동화되어 있으며, 결과는 1시간 이내에 확인 가능합니다.
제약업계에서 Mycoplasma hyorhinis를 통제할 추가적인 방법은 무엇입니까??
Chandler, Volokhov and Chizhikov는 M. hyorhinis는, 그리고 아마도 몰리쿠테스강 세균 전부에 대해서도 동일하게는, 펩톤을 오염시킬 가능성이 높으며 이를 특히 막아야 한다고 주장하였습니다.
일반적으로 박테리아나 효모를 통해 제조된 백신과 재조합 의약품는 마이코플라스마에 대한 검사를 받지 않아 왔습니다. 제조에 사용되는 미생물이 이러한 배지에서 빠르게 생장하지만 생장 속도가 느린 마이코플라스마의 증식을 보조할 수 없기 때문입니다. 여기에는 하나 고려해야 할 점이 있는데, 최근 보고에 따르면 미생물 및 세포 배양 배지에 사용되는 펩톤(필터로 멸균된 tryptone soya 제품)이 독자생존이 가능한 마이코플라스마, 구체적으로는 M. hyorhinis에 오염될 가능성이 있다는 것입니다 6. 이러한 관측 결과는 모든 원재료를 잠재적인 마이코플라스마 오염에 대해 주의 깊게 평가하거나 독자생존이 가능한 마이코플라스마를 함유한 원재료를 사용하는 위험을 줄일 수 있는, 원재료를 자외선으로 전처리하는 등의 절차를 수립하는 것의 중요성을 증가시킵니다.
산업 통제 가이드라인(혹은 통제 조치)는 Mycoplasma hyorhinis를 배지, 혈청, 그리고 공정 구성 요소 등에서 효과적으로 통제할 방법에 대한 권고사항을 제공합니다. 문서화된 공급자 관리 프로그램을 통한 선택적인 구매, 우수 의약품 제조·관리 기준(GMP), 위해요소 중점관리기준(HACCP), 선행 조건 프로그램, 그리고 탄탄하고 지속적인 개선 활동에 중점이 두어집니다.
이는 모든 공장이 Mycoplasma hyorhinis 감소라는 목표를 달성하기 위해 사용할 수단입니다. 원재료 구매 관행, 재료 배송/수령, 물리적 시설, 공장 직원 및 방문객, 공장의 절차 및 규정(청결 및 청소, 해충 통제, 물품 취급, 먼지 제어 및 공기 흐름, 습기 제어), 장비 유지보수 및 운용, 포장, 보관 및 운송, 제어 조치, 샘플 채취 및 분석에 중점이 두어집니다.
Mycoplasma hyorhinis의 영향을 받는 업계에는 무엇이 있습니까?
Mycoplasma hyorhinis는 세포 배양 기법을 사용하는 모든 바이오 의약 분야에 중요합니다.
bioMérieux 솔루션 및 제품
BioFire® Mycoplasma panel
BioFire® Mycoplasma Panel은 완전히 자동화된 닫힌 “주머니 속의 연구소” 시스템으로, 5분 이내의 조작만으로 몰리쿠테스강 세균에 대한 민감하고 폭넓은 검출 능력을 제공합니다. 일회용 시약 파우치는 핵산 정제 및 nested multiplex 실시간 PCR을 결합하며, 가동에 훈련과 기술이 거의 필요하지 않으며, 가동 시간은 1시간 미만입니다.
15개의 서로 다른 PCR 분석이 각 시행마다 수행되어 Acholeplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Mycoplasma, Phytoplasma, Spiroplasma, Ureaplasma속을 포함한 몰리쿠테스강의 폭넓은 유전적 다양성에 대처합니다. 3개의 내부 조절장치가 파우치 기능의 샘플 추출부터 증폭 및 검출까지의 모든 요소를 모니터링해 결과의 신뢰성을 보장합니다.
수재 검사 기준을 만족하기 위해 디자인된 이 제품에 대해서 검출 한계(LoD) 연구가 미국, 유럽, 일본 약전에 수록된 종들에 대해 중점적으로 샘플 부피 0.2mL 및 10mL에 대해 시행되었습니다. 10mL 샘플의 LoD는 검사한 모든 마이코플라스마에 대해 ≤ 10CFU/mL이며, 원심분리를 통한 몇 개의 간단한 전처리 단계만을 필요로 합니다. 0.2mL 샘플의 직접 검사는 ≤ 33CFU/mL를 검출할 수 있으며, 원재료, 세포주 은행, 초기 중간재, 그리고 세포치료제와 같은 양이 한정되어 있는 생물제제 등을 더 자주 모니터링하도록 촉진하기 위해서 개발되었습니다.
References
1 Considerations for risk and control of mycoplasma in bioprocessing, Angart et al., Current Opinionin Chemical Engineering, 2018,22:161–166.
2 The scope of mycoplasma contamination within the biopharmaceutical industry, Armstrong, Mariano , Lundin., Biologicals. 2010 Mar;38(2):211-3. doi: 10.1016/j.biologicals.2010.03.002.
3 Low IE. Isolation of Acholeplasma laidlawii from commercial serum free tissue culture medium and studies on its survival and detection. Appl Microbiol 1974:1046–52.
4 Beardsley T. Contamination at flow labs. Nature 1983;304:674.
5 Complete Genome and Proteome of Acholeplasma laidlawii, Lazarev et al., Journal of 5 Bacteriology Aug 2011, 193(18) 4943-4953; DOI: 10.1128/JB.05059-11.
6 PDA(2010) Technical Report No. 50: Alternative Methods for Mycoplasma Testing. Bethesda, MD.
