Desenvolvimento e validação do ensaio de qualidade da cerveja

A INVISIBLE SENTINEL foi fundada em 2006 com o objetivo de revolucionar o diagnóstico molecular. Embora muitas plataformas de teste baseadas em PCR estivessem disponíveis, elas tinham alguns problemas inerentes. Os métodos rápidos existentes eram complexos e dispendiosos ou tinham limitações em relação a sensibilidade e exatidão. A missão da INVISIBLE SENTINEL era melhorar radicalmente este aspecto, desenvolvendo uma nova tecnologia molecular conhecida como VERIFLOW^®.
VERIFLOW^®  foi concebido para melhorar a experiência do usuário, reduzindo significativamente o capital investido e os custos operacionais associados às tecnologias de PCR existentes. Foi também pensado com um conjunto abrangente de características para satisfazer as diversas necessidades dos usuários de várias indústrias de alimentos e bebidas. A tecnologia foi o encontro de muitos anos de desenvolvimento e utiliza princípios científicos comprovados para a detecção microbiológica, juntamente com novas abordagens científicas proprietárias para alcançar um desempenho excelente. O resultado é uma plataforma tecnológica que utiliza a tecnologia exclusiva de captura de DNA  - um novo método de amplificação e identificação de DNA associado a um fluxo de trabalho simples e virtualmente livre de custos adicionais desde a coleta de amostras até à interpretação de dados. VERIFLOW^® tem sido aplicado em múltiplas indústrias, incluindo segurança dos alimentos e qualidade das bebidas, com foco na indústria da cerveja. Desde o lançamento da BREWPAL^® em abril de 2015, a INVISIBLE SENTINEL tem trabalhado com cervejarias líderes da indústria em todo o mundo para abordar as suas preocupações com a qualidade microbiológica. Centenas de cervejarias, em mais de 15 países, agora utilizam a tecnologia VERIFLOW^® para proteger as suas marcas e assegurar que a sua cerveja cumpre os mais rigorosos padrões de qualidade.

Combinando novas abordagens científicas, a VERIFLOW^® conta com a robusta tecnologia de PCR de ponto final com a detecção em fluxo verticalizado.
O processo começa com a amplificação do DNA alvo, uma etapa essencial subjacente ao diagnóstico molecular por PCR. A amplificação é o processo de aumentar o número de cópias de uma sequência específica de DNA ("assinatura de DNA") a níveis detectáveis. Há uma série de diferentes tecnologias de amplificação, no entanto, VERIFLOW^® utiliza uma abordagem de propriedade específica. As enzimas exclusivas utilizadas por VERIFLOW^® durante a amplificação são projetadas para serem robustas e resistentes à inibição. Isto permite que o processo de amplificação ocorra sem interferência de inibidores naturalmente presentes em várias amostras. As abordagens tradicionais requerem purificação rigorosa das amostras para remover os inibidores e assegurar uma amplificação bem sucedida. As enzimas exclusivas da VERIFLOW e as tecnologias de inativação de inibidores eliminam a necessidade de purificação de amostras ou extração de DNA, reduzindo assim significativamente a complexidade do processo global de testes. Esta melhoria no fluxo de trabalho e na robustez permite uma discussão de uma série de vantagens, o que faremos posteriormente neste artigo.

O próximo passo no processo de detecção é a detecção eficiente do DNA alvo amplificado a partir da amostra. Ao contrário das metodologias tradicionais baseadas em PCR em tempo real (RT-PCR/qPCR), VERIFLOW^® não utiliza a detecção ótica do DNA amplificado. A detecção ótica tem alguns inconvenientes, incluindo a exigência de "limpar" amostras para evitar interferências com sensores óticos. Alternativamente, a utilização de um sistema exclusivo de detecção de "assinaturas de DNA" permite à VERIFLOW^® capturar DNA amplificado num dispositivo de testagem portátil. O DNA alvo liga-se à linha de teste neste dispositivo para permitir uma fácil interpretação do resultado.
O último avanço significativo no desenvolvimento de VERIFLOW foi o de incluir a capacidade do DNA fluir através de um conjunto de capilares para conseguir a detecção e visualização final dos resultados no dispositivo portátil. A VERIFLOW^® desenvolveu uma abordagem de fluxo verticalizado robusta e viável. Esta abordagem, combinada com modificações físicas e qualitativas nos materiais que medeiam o fluxo, permite que o DNA intacto alcance com sucesso a linha de teste final. O fluxo vertical permite resultados instantâneos e reduz significativamente o retrabalho, duas limitações associadas frequentemente à tecnologia de lateral flow, uma categoria alternativa de tecnologias de diagnóstico rápido. Os resultados de VERIFLOW^® são qualitativos e quantitativos, este último por meio de um Leitor Ótico que permite a detecção e enumeração para avaliação do risco microbiano.

Metodologia sem Extração de DNA
Historicamente, os métodos moleculares têm melhorado muito a especificidade e a sensibilidade, mas são dispendiosos, de execução complexa, e requerem equipamento especializado e pessoal altamente treinado. Alguns dos fatores que contribuem para o elevado custo são a necessidade de elaborado preparo de amostras antes da amplificação PCR, seguida da detecção ótica dos subprodutos, utilizando equipamentos de restrito acesso. Os métodos baseados em qPCR seguem etapas complexas de extração de DNA devido à presença de agentes inibidores na cerveja. A inibição do PCR pode ser causada pela inativação da enzima e/ou interações inespecíficas dos iniciadores (primers) e do DNA alvo. Nestes métodos, a não-utilização de uma amostra de DNA altamente purificada pode aumentar a probabilidade de resultados falso-positivos e falso-negativos. VERIFLOW^® foi pensado para superar estes desafios. A tecnologia emprega uma metodologia sem extração de DNA que reduz significativamente o tempo de preparo de amostras para o tubo PCR. Tecnologia em tampões robustos junto com polimerases de DNA resistentes aos inibidores, não só proporcionam uma estabilidade e sensibilidade excepcionais, como também permitem uma amplificação eficiente dos alvos de DNA, diretamente a partir de amostras de alimentos crus, eliminando assim a necessidade de purificação do DNA. O desempenho destas variantes enzimáticas é ainda melhorado através da utilização de novas estratégias de tratamento de amostras que simplificam, aceleram e reduzem o custo em comparação com outros testes complexos baseados em PCR. A eliminação da purificação de amostras reduz substancialmente a manipulação de amostras, reduzindo assim o risco de erro operacional. As reações VERIFLOW^® PCR são ainda protegidas da potencial contaminação por transporte através da substituição do dTTP (trifosfato deoxitimidina) por dUTP (trifosfato deoxiuridina) na mistura de dNTP (desoxinucleotídeos) juntamente com a Glicosilase de Uracila (UDG). Antes do início do PCR, a ativação UDG cliva a base uracil-DNA de quaisquer DNA contendo dUTP (ou seja, amplicons remanescentes), impedindo a reamplificação do amplicon em caso de contaminação ambiental por amplicon.

Amplificação de DNA
O PCR é uma técnica in vitro que permite a multiplicação de uma sequência específica de DNA numa amostra. Devido à sua elevada sensibilidade e especificidade, o PCR tornou-se uma técnica popular na área da biotecnologia e do diagnóstico. O processo utiliza oligonucleótidos complementares (primers) para reconhecer especificamente uma única sequência genética no genoma alvo. Este fragmento específico de DNA é submetido a um processo cíclico de aquecimento e resfriamento em três etapas, também conhecido como ciclagem térmica, num tubo com reagentes de PCR contendo um "master mix" de DNA polimerase, nucleotídeos, e primers. Para a linha ensaios da VERIFLOW^® este processo é realizado no VERIPRO^® Thermocycler.

Os três ciclos do PCR:

- Desnaturação: O DNA alvo, de cadeia dupla, é desnaturado a uma temperatura elevada em duas cadeias separadas e simples.

- Anelamento do Primer: A temperatura é reduzida para permitir que os dois oligonucleótidos sintéticos (ou primers) se hibridizem para o DNA alvo.

- Extensão: A temperatura é aumentada para permitir um processo de polimerização, onde uma molécula de DNA de fita dupla (amplicon) recém marcada, é gerada pela extensão do espaço entre os primers complementares DNA molde.

As três etapas são repetidas mais de 30 vezes (dependendo do alvo de interesse), resultando numa amplificação exponencial do DNA alvo.

Visualização dos Resultados
Um dos elementos mais desafiadores para satisfazer as necessidades de testes moleculares da indústria da cerveja é simplificação da interpretação dos dados. A utilização de interpretação de dados automática por softwares aumenta o custo do equipamento e a complexidade do fluxo de trabalho. As taxas anuais de manutenção e os contratos de serviço também aumentam o já elevado custo do equipamento.
A VERIFLOW^® é única. A visualização de resultados através da VERIFLOW^® resulta de uma tecnologia de fluxo vertical incluída em um dispositivo portátil. Na aplicação da amostra, o conjugado coloidal de proteína-ouro é reidratado e reage com o amplicon marcado da amostra. Esta mistura flui verticalmente sobre uma membrana de nitrocelulose imobilizada com anticorpos de captura na linha de ensaio. O amplicon, circundado pelo o conjugado coloidal de proteína-ouro e pelos anticorpos de captura, agrega-se na linha de teste para gerar uma linha púrpura visualmente detectável, indicando a presença de contaminação em apenas três minutos após a aplicação da amostra. A membrana também contém uma linha de controlo, sendo que uma única linha indica um resultado negativo e duas linhas indicam um resultado positivo.
Para obter resultados quantitativos, a intensidade da linha de teste pode ser medida utilizando o VERIFLOW^® Reader. O dispositivo é encaixado no suporte do leitor para que cada um seja individualmente analisado. O leitor é programado de forma que mede a relação da linha de teste com a intensidade da linha de controle e correlaciona esse valor com a sua curva de calibração interna. Usando este algoritmo incorporado, o leitor exibe resultados quantitativos (células/mL) dos dispositivos de teste, gerando um número de células associado àquela intensidade da linha de teste.

Informação básica sobre deterioração da cerveja
A cerveja é uma bebida de baixo pH (3,8 - 4,7), alcoólica (0,5 - 10% p/v), reconhecida como um produto microbiologicamente estável. A falta de nutrientes e oxigênio (< 0,1 ppm), juntamente com níveis elevados de dióxido de carbono (0/5 p/p) e efeitos antimicrobianos dos ácidos do lúpulo (17 - 55 ppm de iso-α-ácidos), criam um ambiente desfavorável para a sobrevivência e crescimento de microrganismos deteriorantes. Apesar das condições aparentemente desfavoráveis, os deteriorantes da cerveja conseguem inadvertidamente entrar em levedos, tanques de fermentação, tanques de armazenamento, e no produto embalado. O resultado é um aumento da turbidez e alterações sensoriais indesejadas na cerveja. Apesar do envase asséptico de cerveja, pode ocorrer contaminação biológica pós-embalagem devido a pasteurização ou filtração ineficazes, resultando em efeitos adversos no produto embalado. A deterioração da cerveja tem impacto na qualidade do produto e pode causar graves perdas econômicas para uma cervejaria.

Portfólio de Ensaios
A INVISIBLE SENTINEL propôs-se a desenvolver um menu de produtos criado com uma seleção de seis principais categorias de deteriorantes de cerveja (Tabela 1).
Cada ensaio do portfólio foi intencionalmente desenvolvido e amplamente validado para satisfazer os mais elevados padrões de inclusão, exclusão e robustez geral. Este documento irá detalhar o desenvolvimento e validação do primeiro e principal ensaio, BREWPAL^®. Todos os ensaios seguiram o mesmo processo de alta qualidade resumido abaixo durante o desenvolvimento e validação.

A indústria cervejeira cresceu exponencialmente ao longo da última década, com a entrada de novos players no mercado. Devido à variedade de estilos de cerveja e à complexidade de produção, a gestão da qualidade tornou-se, mais do que nunca, um diferencial determinante. Atualmente, a necessidade de informação precisa e acionável durante a produção e após o envase é essencial para manter a qualidade e proteger a imagem da marca.

Se aplicados corretamente, os métodos tradicionais de testes de qualidade podem identificar problemas, mas não com rapidez e eficácia. O atraso na informação leva à tomada de decisões reativas em relação à qualidade, ou seja, já depois dos danos terem sido causados. Além disso, estas tecnologias requerem normalmente fluxos de trabalho dispendiosos e complicados. Finalmente, os resultados dos testes podem ser ambíguos no que diz respeito ao risco de deterioração por um micro-organismo específico. A abordagem de detecção de deteriorantes em tempo real é crítica para evitar a contaminação de instalações, retenção de produtos, ou o envio de cerveja sob risco de contaminação.

Para enfrentar estes desafios, a INVISIBLE SENTINEL desenvolveu BREWPAL^® e os outros ensaios para fornecer rapidamente, ensaios acessíveis e de fácil utilização - sem prejuízo da sensibilidade, especificidade, ou precisão. Análises de matrizes desafiadoras sem extração e/ou purificação de DNA, possíveis apenas com VERIFLOW^®, ajudam a reduzir o tempo e custo de manuseio e envio de amostras . A BREWPAL^® e os produtos VERIFLOW para cervejas foram amplamente adotados pelas principais cervejarias em todo o mundo e a tecnologia tornou-se rapidamente a metodologia líder da indústria para testes microbiológicos. A BREWPAL^® e o portfólio completo de produtos VERIFLOW contemplam uma grande variedade de organismos e podem ser utilizados durante todo o processo de fabricação da cerveja, em produtos acabados, e para testes ambientais. 
Estes produtos oferecem simplicidade, robustez, e preços acessíveis.