莱氏无胆甾原体：细胞培养基的潜在工艺污染物

转到：

什么是莱氏无胆甾原体?

无胆甾原体是一种革兰阴性杆菌属，属于柔膜菌纲。柔膜菌纲包括支原体和无胆甾原体。柔膜菌纲没有细胞壁，体积很小 (200-300 nm) 且基因组也小。由于柔膜菌纲无法产许多生存所需的酶，因此其需要寄生在真核细胞上。莱氏无胆甾原体是于 1936 年首次从伦敦未经处理的污水中分离出来的。莱氏无胆甾原体是广泛分布的腐生菌，也是许多动物和鸟类的上呼吸道粘膜和泌尿生殖道的偏利共生物 ¹。^{鉴于莱氏无胆甾原体在自然界中的广泛存在，因此人们将其视为所有细胞培养基类型中常见的细胞培养基污染物。经确定，前五大细胞培养污染物 (95%) 包括：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾原体或人支原体 ²。

柔膜菌纲体积小，具有流体结构，无细胞壁，使其容易逃过适用于含有其他微生物类型的检测和控制方法。

柔膜菌纲无细胞壁，并且在高压下可以穿透杀菌过滤器，包括滤膜孔径为 0.1 mm 的过滤器。通过杀菌过滤器的数量非常少，这又增加了在生产后的检测中无法检测到污染物的可能性。（Windsor、Windsor 和 Noordergraaf）。

本文旨在概述莱氏无胆甾原体的特征，莱氏无胆甾原体的许多特征与其他支原体相同，并给出了用于确保正确检测和控制的措施。}

莱氏无胆甾原体是如何成为潜在工艺污染物的？

莱氏无胆甾原体可能存在于天然原料中，尤其是包括牛血清和胰蛋白酶大豆肉汤在内的细胞培养物的粉状添加剂中。莱氏无胆甾原体可以在支原体培养基中生长，表明其养分需求很低。人们已经认识到在生产工艺中使用过滤器灭菌（与加热灭菌相反）与莱氏无胆甾原体污染事件的增加有关。

支原体和无胆甾原体污染事件会改变细胞培养物的属性，可能改变细胞副产物，甚至影响生物药品的质量。

如何避免细胞培养基中出现莱氏无胆甾原体？

如果预计细胞培养工艺的整体污染率为 15 至 35%，则可以看出所使用的细胞培养物中存在大量支原体（包括莱氏无胆甾原体）³，这是生物技术领域中主要使用的一项技术。

目前，莱氏无胆甾原体的分离与是否使用无血清培养基之间的关联不大^{4 5}。因此，在可能的情况下，可以选择无血清培养基。其他预防措施包括使用热灭菌水（而非过滤水）在培养基中复溶粉末。Laidlaw 和 Elford 发现，培养物在 55℃ 温度下的存活时间不超过 5 分钟，45℃ 下 15 分钟后数量显著减少。Windsor、Windsor 和 Noordergraaf 证实了这些结果，其中在 50℃ 和 60℃ 下二十分钟内莱氏无胆甾原体的存活数量减少到零，但在 40℃ 下并没有。据这些研究人员的说法：“…目前还不知道莱氏无胆甾原体

是如何成为粉状物质的生物负荷的一部分的，或类似粉状物质（蛋白胨或蛋白）是否为无血清细胞培养基中的该类污染物的唯一潜在来源。”此外，“这种生物体穿透杀菌过滤器，并随后在冷藏温度下储存的简单蛋白胨肉汤或细胞培养基配方中生长成高滴度的能力对生物制药行业有着巨大的影响。”

制药行业是如何检测是否存在莱氏无胆甾原体的？

监管机构普遍要求检测制药环境中是否存在此类污染物。该检测的指南见美国药典 (USP) 第< 63 >章支原体检测、欧洲药典 (EP) 第 2.6.7 章支原体检测、FDA 1993 年考虑要点 (PTC) 和《联邦法规》 21 CFR 610.30 支原体检测。

支原体类污染物，比如莱氏无胆甾原体，很容易被忽视，因为即使在高滴度下，肉眼和光学显微镜也观察不到。需要进行常规检测，以确保细胞培养物未被污染，并且后续批次也不会被最初污染的批次进一步感染。检测方法包括：在肉汤/琼脂上直接生长、DNA 特异性染色、PCR、ELISA、核 RNA 标记和酶法。

市面上有许多检测支原体的技术，每种技术都有其相关优缺点。优势类别包括了一系列的柔膜菌纲检测并对所检测的各个种属具有专属性。低假阳性结果也很重要。劣势方法会得出假阳性结果，耗时耗力，并且缺乏所需的专属性。

考虑到莱氏无胆甾原体 ⁶和其他柔膜菌纲的全基因组测序，使用 PCR 探针可以进行快速且专属性检测。用于检测支原体的 BioFire®支原体板，包括莱氏无胆甾原体的一个引物和一个完整的其他柔膜菌板。供试品制备和检测性能简单且自动化，并且可以在一个小时内出结果。

生物制药行业是否存在其他用于避免出现莱氏无胆甾原体的控制措施？

Chandler、Volokhov 和 Chizhikov 声称莱氏无胆甾原体可能更容易污染蛋白胨（支原体总体上都是如此），应专门排除。
一般来说，目前尚未对使用细菌或酵母生产的疫苗和重组产品进行支原体检测，主要是因为所生产的生物体可以在预计无法对缓慢生长的支原体进行复制的培养基中快速生长。然而，基于最近的报告可以得出一个警告，即微生物和细胞培养基中使用的蛋白胨（如经过滤灭菌的胰蛋白胨大豆制品）可能被活的支原体污染，特别是莱氏无胆甾原体⁷。根据观察结果，仔细评估所有原料是否存在潜在的支原体污染，或者是否制定了用于降低原料中存在活的支原体风险的规范变得非常重要，例如通过紫外线辐射对原料进行处理。

行业控制指导方针（或控制措施）给出了如何最有效地控制培养基、血清和工艺成分等中的莱氏无胆甾原体的建议。
重点放在根据记录的供应商管理计划进行选择性采购、药品生产质量管理规范 (GMP)、危害分析和关键控制点 (HACCP)、先决条件计划和稳健的持续改进活动。

这些是所有工厂完成减少莱氏无胆甾原体目标的措施。重点在于原料采购规范、配料运输/接收、实体设施、工厂员工和访客、工厂规范和政策（卫生和清洁、害虫控制、材料处理、粉尘控制和气流以及水分控制）、设备维护和操作、包装、储存和运输、控制规范以及取样和分析。

莱氏无胆甾原体影响哪些常见行业？

莱氏无胆甾原体对于所有采用细胞培养技术的生物制药领域来说都很重要。

生物梅里埃解决方案和产品

BioFire®支原体板

BioFire^®支原体板是一个封闭的全自动“袋中实验室”系统，该系统可在五分钟内对柔膜菌纲进行高度灵敏且广泛的检测。一次性试剂袋集成了核酸纯化和嵌套式多重实时 PCR，运行时间不到一小时，并且只需最少的培训和操作技能就能操作。
每次运行需要进行 15 次不同的 PCR 含量测定，以涵盖柔膜菌纲的遗传多样性，包括无胆甾原体属、虫原体属、中原体属、支原体属、植原体属、螺原体属和脲原体属。从样品提取到扩增检测，通过监测小袋各方面的功能，用三个内部对照品确保结果的可靠性。
为了满足药典检测标准，已采用 0.2 mL 和 10 mL 样品量对美国、欧洲和日本药典列出的种属进行了检测限 (LoD) 研究。所有待测支原体的 10 mL 样品的 LoD ≤ 10 CFU/mL，并且只要求通过离心进行一些简单的预处理。0.2 mL 样品的直接检测结果为 ≤33 CFU/mL，直接检测旨在增加原料、细胞库、早期产品中间体和细胞疗法等体积有限的生物制品监测频率。

参考文献

¹ 莱氏无胆甾原体在培养基产品中的生长和长期存活情况 Helena M. Windsor、G. David Windsor 和 J.H。Noordergraaf，Biologicals 38（2010 年）204–210。
²生物工艺中的支原体风险和控制考量 Angart 等人，Current Opinionin Chemical Engineering，2018 年，22：161–166。
³生物制药行业中支原体污染的范围，Armstrong、Mariano 和 Lundin，生物制品。2010 年 3 月；38（2）：211-3. doi：10.1016/j.biologicals.2010.03.002。
⁴ 低 IE。从商业无血清组织培养基中分离莱氏无胆甾原体以及其存活和检测研究。1974 年 Appl Microbiol：1046–52。
⁵ Beardsley T.流动化学实验室中的污染。1983 年《自然》；304：674。
⁶ 莱氏无胆甾原体的完整基因组和蛋白质组，Lazarev 等人，Journal of Bacteriology 2011 年 8 月，193（18）4943-4953；DOI：10.1128/JB.05059-11。 ⁷ PDA（2010 年）第 50 号技术报告：支原体的替代检测方法。 Bethesda，医学博士。