Acholeplasma laidlawii : contaminant potentiel des procédés de transformation des milieux de culture cellulaire
Qu'est-ce que l'Acholeplasma laidlawii ?
Acholeplasma est un genre de bacilles à Gram négatif appartenant à la classe des Mollicutes Les Mollicutes comprennent les Mycoplasma et Acholeplasma. Les Mollicutes ne possèdent pas de paroi cellulaire, sont extrêmement petites (200 à 300 nm) et ont un petit génome. Étant donné que les Mollicutes sont incapables de produire la plupart des enzymes nécessaires à leur survie, elles parasitent les cellules eucaryotes. Acholeplasma laidlawii a pour la première fois été isolé dans des eaux usées à Londres en 1936. Ce sont des saprophytes répandus ainsi qu'une bactérie commensale de la muqueuse des voies respiratoires supérieures et du tractus urogénital de nombreuses espèces d'animaux et d'oiseaux 1. Compte tenu de sa généralisation dans la nature, elle est définie comme un contaminant commun de tous les types de milieux de culture cellulaire. Les cinq principaux contaminants de culture cellulaire (95 %) identifiés sont les suivants : Mycoplasma orale, Mycoplasma arginini, Mycoplasma hyorinis, Mycoplasma fermentans, Acholeplasma laidlawii ou Mycoplasma hominis 2.
La petite taille et la structure souple des Mollicutes due à l'absence de paroi cellulaire contribuent à leur capacité à échapper aux méthodes de détection et de contrôle adaptées à d'autres types de microorganismes.
Dépourvues de paroi cellulaire, les Mollicutes peuvent pénétrer sous haute pression dans les filtres stérilisants, y compris les filtres de 0,1 mm. Le fait que seul un très faible nombre pourrait traverser les filtres stérilisants augmente la probabilité de ne pas détecter la contamination durant les tests de post-production. (Windsor, Windsor et Noordergraaf).
Cet article cherche à présenter les caractéristiques d'Acholeplasma laidlawii, dont beaucoup sont communes à d'autres mycoplasmes, et suggère des mesures à mettre en place pour garantir leur détection et leur contrôle.
Comment Acholeplasma laidlawii est-il devenu un contaminant potentiel des procédés de transformation ?
Acholeplasma laidlawii peut être présent dans les matières premières d'origine naturelle, en particulier les additifs en poudre pour la culture cellulaire, comme le sérum bovin et le bouillon trypticase soja. La croissance d'A. laidlawii en milieu mycoplasme simple suggère que ses besoins nutritionnels sont minimes. Le lien a été reconnu entre l'augmentation du recours à la stérilisation par filtre pour la production de procédés (contrairement à la stérilisation thermique) et la multiplication des événements de contamination par Acholeplasma laidlawii.
Les événements de contamination par Mycoplasma et Acholeplasma peuvent altérer les propriétés des cultures cellulaires et des sous-produits cellulaires, voire compromettre des produits biopharmaceutiques.
Comment empêcher Acholeplasma laidlawii de se développer dans les milieux de culture cellulaire ?
L'occurrence significative de mycoplasmes, y compris A. laidlawii, dans les cultures cellulaires réalisées, une technologie majeure du domaine de la biotechnologie, permet d'estimer entre 15 et 35% les taux de contamination de tous les processus de culture cellulaire 3.
L'isolement d'Acholeplasma laidlawii a été moins souvent associé à l'utilisation de milieux sans sérum 4 5. Par conséquent, et dans la mesure du possible, un milieu sans sérum est préférable. Des précautions supplémentaires incluent l'utilisation d'eau stérilisée par la chaleur, plutôt que filtrée, pour la reconstitution des poudres incluses dans les milieux. Laidlaw et Elford ont découvert que les cultures ne pouvaient pas résister à 55 °C pendant 5 min et ont noté une réduction considérable de leur nombre après 15 min à 45 °C. Windsor, Windsor et Noordergraaf ont confirmé ces résultats d'anéantissement de l'Acholeplasma laidlawii en vingt minutes à 50 °C et 60 °C mais pas à 40 °C. Selon ces mêmes chercheurs : « ... on ne sait pas actuellement comment la bactérie A. laidlawii s'introduit dans la biocharge des poudres ou encore, si des poudres similaires (peptones ou albumen) sont la seule source potentielle de ce contaminant dans les milieux de culture cellulaire sans sérum. » Et, « Le fait que cet organisme puisse traverser les filtres stérilisants et atteindre un titre élevé dans de simples bouillons peptonés ou dans des formulations de milieu de culture cellulaire stockées à des températures de réfrigération, comporte de sérieuses implications pour l'industrie biopharmaceutique. »
Comment détecter la présence d'Acholeplasma laidlawii dans l'industrie pharmaceutique ?
La recherche de tels contaminants dans l'industrie pharmaceutique est une exigence universelle des organismes de réglementation. Des directives pour ce test sont fournies dans le chapitre <63> des tests sur les mycoplasmes de la Pharmacopée des États-Unis (USP), le chapitre 2.6.7 sur les Mycoplasmes de la Pharmacopée européenne (EP), les 1993 points à considérer (PTC) de la FDA et le test pour mycoplasme du Code of Federal Regulations 21 CFR 610.30.
Les contaminants de type mycoplasme tels que Acholeplasma laidlawii peuvent facilement passer inaperçus car ils restent invisibles à l'œil nu et à la microscopie optique même à des titres élevés. Des tests de routine sont nécessaires pour s'assurer que les cultures cellulaires ne sont pas contaminées et même que les lots suivants ne sont pas à leur tour infectés par un lot initialement contaminé. Les méthodes de détection comprennent : la croissance directe sur bouillon/gélose, la coloration spécifique de l'ADN, les tests PCR et ELISA, le marquage de l'ARN et les procédures enzymatiques.
Un certain nombre de technologies commercialisées permettent de détecter des mycoplasmes en général, chacune comportant ses propres avantages et inconvénients. Parmi les avantages à rechercher, on visera une large couverture de détection des Mollicutes et une spécificité pour chaque espèce détectée. Un faible taux de faux positifs est aussi important. Les méthodes moins performantes donneront des faux positifs, nécessiteront beaucoup de temps et de travail, et n'apporteront pas la spécificité souhaitée.
Compte tenu du séquençage du génome complet d'Acholeplasma laidlawii 6 et d'autres Mollicutes, les sondes PCR permettent leur détection rapide et spécifique. Le nouveau test BioFire® Mycoplasma de détection des mycoplasmes comprend une amorce pour l'A. laidlawii ainsi qu'un panel complet d'autres Mollicutes. La préparation des échantillons d'analyse et l'exécution des tests sont simples et automatisées. Les résultats sont ainsi prêts en moins d'une heure.
D'autres contrôles ont-ils été utilisés pour prévenir l'apparition de Acholeplasma laidlawii dans l'industrie biopharmaceutique ?
Chandler, Volokhov et Chizhikov affirment que A. laidlawii peut être plus susceptible de contaminer les peptones que les mycoplasmes en général et devrait être spécifiquement écarté.
En général, les vaccins et les produits recombinants tirés des bactéries ou des levures ne sont pas testés pour les mycoplasmes, principalement parce que ces organismes de production se développent rapidement dans des milieux qui ne devraient pas favoriser la réplication des mycoplasmes à croissance lente. Il existe cependant une mise en garde, fondée sur les rapports récents selon lesquels les peptones (ex. : les produits à base de tryptone de soja stérilisés par filtration) utilisés dans les milieux de culture microbiologique et cellulaire peuvent être contaminés par des mycoplasmes viables, en particulier par la bactérie A. laidlawii 7. Compte tenu de cette observation, il est important d'évaluer soigneusement toutes les matières premières pour détecter toute contamination potentielle par les mycoplasmes ou de mettre en place des procédures pour maîtriser le risque de matières premières contenant des mycoplasmes viables, comme le prétraitement des matières premières par rayonnement ultraviolet.
Les directives de contrôle (ou mesures de contrôle) du secteur fournissent des recommandations sur la meilleure façon de contrôler efficacement la Acholeplasma laidlawii, par exemple dans les milieux, les sérums et les composants du processus.
L'accent est mis sur des achats sélectifs avec un programme de gestion des fournisseurs documenté, de bonnes pratiques de fabrication (BPF), un système d’analyse des risques et de maîtrise des points critiques (HACCP), des programmes prérequis et des activités d'amélioration continue efficaces.
Ces moyens sont à la portée de toutes les usines pour les aider à réduire les Acholeplasma laidlawii. Une attention particulière est ici prêtée aux pratiques d'achat des matières premières, à l'expédition/la réception des ingrédients, aux installations physiques, aux employés et visiteurs des usines, aux procédures et politiques des usines (assainissement et nettoyage, lutte antiparasitaire, manipulation des matériaux, contrôle de la poussière et du flux d'air, contrôle de l'humidité), à l'entretien et au fonctionnement des équipements, à l'emballage, au stockage et au transport, aux procédures de contrôle, à l'échantillonnage et à l'analyse.
Quelles sont les principales industries touchées par A. laidlawii ?
A. laidlawii concerne tous les secteurs biopharmaceutiques employant des techniques de culture cellulaire.
Solutions et produits bioMérieux
Test BioFire® Mycoplasma
Le test BioFire® Mycoplasma est un système de « pochette labo » fermé et entièrement automatisé, capable d'une détection très sensible et large des Mollicutes avec un temps de manipulation n'excédant pas cinq minutes. La pochette de réactif jetable purifie les acides nucléiques et effectue une PCR multiplexe « nichée » en temps réel. Elle fournit des résultats en moins d'une heure et ne nécessite qu'une formation et des compétences minimales.
Quinze tests PCR différents sont inclus dans chaque cycle pour couvrir la grande diversité génétique de la classe Mollicutes, y compris les espèces des genres Acholeplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Mycoplasma, Phytoplasma, Spiroplasma et Ureaplasma. Trois contrôles internes garantissent la fiabilité des résultats grâce à la surveillance de tous les aspects de la fonction de la poche, de l'extraction de l'échantillon à la détection des amplicons.
Conçues pour répondre aux normes officinales de détection, les études de limite de détection (LoD) ont été réalisées en portant une attention particulière aux espèces répertoriées par les pharmacopées américaine, européenne et japonaise avec des volumes d'échantillons de 0,2 ml et 10 ml. La LoD pour les échantillons de 10 ml est ≤ 10 UFC/ml pour tous les mycoplasmes testés et ne nécessite que quelques étapes simples de prétraitement par centrifugation. Permettant de détecter une concentration ≤ 33 UFC/ml, le test direct d'échantillons de 0,2 ml est destiné à faciliter une surveillance plus fréquente des matières premières, des banques de cellules, des produits intermédiaires précoces et des produits biologiques avec un volume disponible limité notamment pour les thérapies cellulaires.
Références
1 The growth and long term survival of Acholeplasma laidlawii in media products used in biopharmaceutical manufacturing Helena M. Windsor, G. David Windsor, and J.H. Noordergraaf, Biologicals 38 (2010) 204–210.
2 Considerations for risk and control of mycoplasma in bioprocessing, Angart et al., Current Opinionin Chemical Engineering, 2018, 22:161–166.
3 The scope of mycoplasma contamination within the biopharmaceutical industry, Armstrong, Mariano , Lundin., Biologicals. 2010 Mar ; 38(2):211-3. doi : 10.1016/j.biologicals.2010.03.002.
4 Low IE. Isolation of Acholeplasma laidlawii from commercial serum free tissue culture medium and studies on its survival and detection. Appl Microbiol 1974:1046–52.
5 Beardsley T. Contamination at flow labs. Nature 1983 ; 304:674.
6 Complete Genome and Proteome of Acholeplasma laidlawii, Lazarev et al., Journal of Bacteriology Août 2011, 193 (18) 4943-4953; DOI : 10.1128/JB.05059-11.
7 PDA (2010) Technical Report No. 50 : Alternative Methods for Mycoplasma Testing. Bethesda, MD.
