L'intérêt de la technologie

MALDI-TOF pour l'identification au niveau de l'espèce.

Qu'est-ce que la technologie MALDI-TOF ?

L'ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI) utilise un laser pour absorber l'énergie d'une matrice et générer ainsi des ions par fragmentation des grosses molécules. Elle permet d'analyser des biopolymères tels que l'ADN, les protéines, les peptides, les hydrates de carbone et d'autres macromolécules organiques. Dans la spectrométrie de masse à temps de vol (TOF : Time-of-flight), un analyseur mesure le rapport masse/charge (m/z) des molécules chargées.

Il est essentiel d'identifier et de différencier les microorganismes lors de tests visant à diagnostiquer des maladies, identifier une source de contamination et d’étudier les effets des traitements ou des conditions environnementales sur les populations microbiennes. L'une des méthodes protéomiques les plus puissantes, basée sur la technologie MALDI-TOF, est un moyen rapide, précis et économique de reconnaître et de différencier les microorganismes, tels que les bactéries, les levures, les champignons ainsi que les virus et les parasites. Cette technologie produit des empreintes de spectres de masse spécifiques et uniques pour chaque micro-organisme et permet donc de les identifier avec précision au niveau du genre et de l'espèce.1,2

La spectrométrie de masse MALDI-TOF compare les spectres générés à partir de cellules intactes à ceux d’une base de connaissances d'une manière simple et rapide ; Ce qui la rend compatible pour une utilisation dans un laboratoire de diagnostic. Cette technologie est basée sur la connaissance des pics qui constituent les spectres. Ces spectres uniques sont mémorisés pour identifier les espèces et les sous-espèces, quelles que soient les conditions de culture du microorganisme. 

Une autre caractéristique de la spectrométrie de masse MALDI-TOF consiste à faire correspondre les masses des biomarqueurs à une base de données protéomique. Les protéines sont les biomolécules les plus observées dont le rapport masse/charge est supérieur à 4000 m/z dans les spectres MALDI-TOF dérivés d'extraits de cellules entières. Un algorithme peut donc prédire les masses des protéines à partir d'un génome séquencé et rechercher des correspondances avec les masses obtenues expérimentalement. Cette approche bio-informatique est supérieure à l'empreinte bactérienne, car elle permet d'identifier les microbes malgré les variations des profils protéiques, de la croissance des cultures et des conditions de traitement des échantillons. Elle permet également de détecter les toxines microbiennes et d'analyser la résistance aux antibiotiques.3-6
 

L'importance de l'identification au niveau de l'espèce dans un contexte pharmaceutique. 

Le genre d'un microorganisme n'est pas un indicateur précis de son espèce. Il s'ensuit que l'identification au genre seul n'est pas suffisante pour évaluer les microorganismes en raison de la complexité croissante des communautés microbiennes et de leurs interactions avec l'environnement. Pour un même genre de bactéries, une espèce peut être extrêmement critique et une autre sans danger. L'identification des espèces microbiennes permet d'investiguer sur l’origine de la contamination pour aider les entreprises pharmaceutiques à prendre des décisions. Cette approche est conforme aux dernières recommandations de la Commission Européenne en matière de bonnes pratiques de fabrication (BPF), comme indiqué à l'Annexe 1.

L’Annexe 1 précise que tous les micro-organismes présents dans la zone de grade A (zone d'opérations à haut risque, telle qu'une ligne de fabrication aseptique) ou de grade B (zone tampon pour une zone de grade A) doivent être identifiés jusqu'à leur espèce. Leur  impact potentiel sur la qualité du produit et sur le contrôle de la production doit être établie. Le guide des BPF indique également qu'il est essentiel d'identifier et de prendre en compte les micro-organismes présents dans les zones de propreté C et D (salles blanches destinées aux étapes moins critiques du processus de fabrication, telles que la préparation des solutions). En effet, des seuils d'intervention ou d’alertes dépassés, ou l'isolement de microorganismes critiques sont des indicateurs qui peuvent révéler un défaut du plan de contrôle ou un manque de propreté. Une attention particulière doit être portée aux microorganismes sporulés et aux moisissures qui sont difficiles à surveiller. Lien vers L'annexe 1 des BPF ici .7
 

Avantages essentiels de la technologie MALDI-TOF

La technique MALDI-TOF permet d'identifier les bactéries Gram positif et Gram négatif, les moisissures, les mycobactéries et les microbes anaérobies, permettant d’évaluer la contamination microbienne présente. Cette technique répond à un besoin de détection précoce des microorganismes sur les chaînes de production des produits pharmaceutiques ou dans les laboratoires. La technique MALDI-TOF aide à prévenir la contamination et à éviter ses répercussions financières, telles que les rebuts et les retards de production. Une étude comparative a montré que la technologie MALDI-TOF réduit le délai d'obtention des résultats de 24 à 48 heures à moins de 30 minutes. Les contrôles microbiologiques peuvent ainsi être effectués très rapidement, améliorant la prise de décision dans les investigations menées par l'industrie pharmaceutique.

La technologie MALDI-TOF permet également de détecter des contaminations multiples dans un seul échantillon, ce qui réduit le délai de résultat, sans augmentation des coûts et sans ajout d’étapes supplémentaires dans le processus. L’internalisation de l’identification permet de gagner en autonomie et de réduire les coûts. Une étude comparative a estimé que l'identification par MALDI-TOF nécessitait un temps moyen de 6 minutes pour un coût réduit d'environ 70 à 80 % par rapport aux méthodes conventionnelles.  Les méthodes alternatives, telles que les méthodes basées sur les acides nucléiques, sont coûteuses, chronophages et moins pratiques que la SM (Spectrométrie de Masse) pour leur utilisation régulière en laboratoire. 14-16

 La technologie MALDI-TOF et le VITEK® MS PRIME

bioMérieux a plus de 50 ans d'expertise en microbiologie et a utilisé ses connaissances pour développer un système MALDI-TOF automatisé qui répond aux défis du contrôle de qualité microbiologique. Le laser et la méthode d’acquisition des spectres ont été perfectionnés pour améliorer l'identification des espèces de micro-organismes.

Notre base de données robuste, qui présente une diversité intra-espèce, facilite l'identification des espèces, notamment Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans et Aspergillus brasiliensis. Notre dernière amélioration de la base de données porte sur les moisissures, les mycobactéries et de nombreuses espèces bactériennes critiques, ajoutant 286 espèces supplémentaires pour 186 espèces bactériennes et 107 espèces fongiques. L'algorithme d’interprétation a également évolué pour permettre la différentiation entre  espèces telles que Bacillus cereus et Bacillus thuringiensis.

La base de données VITEK® MS PRIME permet désormais d'identifier en quelques minutes 1 585 espèces représentées par plus de 16 000 souches uniques de bactéries, de levures et de moisissures. Avec une moyenne de 12 souches par espèce et une meilleure efficacité du flux de travail, VITEK® MS PRIME garantit une identification précise et robuste des espèces.
La structure de notre base de données nous permet d'améliorer les performances d'identification des espèces pouvant être critiques pour un groupe pharmaceutique : une étude utilisant la technologie MALDI-TOF avec VITEK® MS PRIME pour différencier les groupes Bacillus cereus et Bacillus subtilis a démontré une grande précision de la différenciation de ces espèces proches sans aucune étape d'extraction. La base de données utilisée dans cette étude comprend 2 745 spectres de référence provenant de 117 espèces du genre Bacillus et d'espèces apparentées. Aucun autre système MS ne peut différencier ces espèces dans son utilisation en routine. 

References:

1.       Croxatto A, Prod'hom G, Greub G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 2012;36(2):380-407. doi:10.1111/j.1574-6976.2011.00298.x

2.       Alizadeh M, Yousefi L, Pakdel F, et al. MALDI-TOF Mass Spectroscopy Applications in Clinical Microbiology. Adv Pharmacol Pharm Sci. 2021;2021:9928238. Published 2021 May 7. doi:10.1155/2021/9928238

3.       Pineda FJ, Lin JS, Fenselau C, Demirev PA. Testing the significance of microorganism identification by mass spectrometry and proteome database search. Anal Chem. 2000;72(16):3739-3744. doi:10.1021/ac000130q

4.       Carbonnelle E, Beretti JL, Cottyn S, et al. Rapid identification of Staphylococci isolated in clinical microbiology laboratories by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 2007;45(7):2156-2161. doi:10.1128/JCM.02405-06.

5.       Alam SI, Kumar B, Kamboj DV. Multiplex detection of protein toxins using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry: application in unambiguous toxin detection from bioaerosol. Anal Chem. 2012;84(23):10500-10507. doi:10.1021/ac3028678

6.       Idelevich EA, Sparbier K, Kostrzewa M, Becker K. Rapid detection of antibiotic resistance by MALDI-TOF mass spectrometry using a novel direct-on-target microdroplet growth assay. Clin Microbiol Infect. 2018;24(7):738-743. doi:10.1016/j.cmi.2017.10.016

7.       EU GMP ANNEX 1. Manufacture of Sterile Medicinal. https://www.gmp-compliance.org/guidelines/gmp-guideline/eu-gmp-annex-1-manufacture-of-sterile-medicinal-products. Accessed April 27, 2023.

8.       Labandeira-Rey M, Couzon F, Boisset S, et al. Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin causes necrotizing pneumonia. Science. 2007;315(5815):1130-1133. doi:10.1126/science.1137165.

9.       Bizzini A, Jaton K, Romo D, Bille J, Prod'hom G, Greub G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry as an alternative to 16S rRNA gene sequencing for identification of difficult-to-identify bacterial strains. J Clin Microbiol. 2011;49(2):693-696. doi:10.1128/JCM.01463-10

10.    Böhme K, Fernández-No IC, Barros-Velázquez J, Gallardo JM, Cañas B, Calo-Mata P. Rapid species identification of seafood spoilage and pathogenic Gram-positive bacteria by MALDI-TOF mass fingerprinting. Electrophoresis. 2011;32(21):2951-2965. doi:10.1002/elps.201100217

11.    Veloo AC, Welling GW, Degener JE. The identification of anaerobic bacteria using MALDI-TOF MS. Anaerobe. 2011;17(4):211-212. doi:10.1016/j.anaerobe.2011.03.026.

12.    Fernández-Olmos A, García-Castillo M, Morosini MI, Lamas A, Máiz L, Cantón R. MALDI-TOF MS improves routine identification of non-fermenting Gram negative isolates from cystic fibrosis patients. J Cyst Fibros. 2012;11(1):59-62. doi:10.1016/j.jcf.2011.09.001

13.    Bille E, Dauphin B, Leto J, et al. MALDI-TOF MS Andromas strategy for the routine identification of bacteria, mycobacteria, yeasts, Aspergillus spp. and positive blood cultures. Clin Microbiol Infect. 2012;18(11):1117-1125. doi:10.1111/j.1469-0691.2011.03688.x

14.    Seng P, Drancourt M, Gouriet F, et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 2009;49(4):543-551. doi:10.1086/600885.

15.    Kajiwara H, Murakami R. Application of RT-PCR and MALDI-TOF MS for the detection of RNA luteovirus. Anal Biochem. 2017;539:45-47. doi:10.1016/j.ab.2017.10.003.

16.    Khodadadi E, Zeinalzadeh E, Taghizadeh S, et al. Proteomic Applications in Antimicrobial Resistance and Clinical Microbiology Studies. Infect Drug Resist. 2020;13:1785-1806. Published 2020 Jun 16. doi:10.2147/IDR.S238446.