PART 1 - 맥주 부패미생물: 주의해야 하는 주요 맥주 부패미생물은 무엇입니까?

인간의 안전 측면에서 역사적으로 맥주는 병원성 미생물이 발견되지 않는다는 점에서 물과 비교했을 때 항상 더 안전한 음료로 간주되었습니다. 이것은 부분적으로 맥아즙을 케틀에서 끓이기 때문일 뿐만 아니라 알코올, 홉 수지, 그리고 낮은 pH 때문이기도 합니다. 다만, 소위 "맥주 부패미생물"라고 불리는 특정 미생물 오염 물질이 맥주에 번식할 수 있으며 이에 따라 바람직하지 않은 맛과 향 뿐만 아니라 맥주를 탁하게 하는 원인이 될 수 있습니다. 

발효의 관점에서, 이 오염 물질들은 "양조 효모 균주"를 방해하고 필수 영양소를 얻기 위해 경쟁할 수 있습니다. 이는 맥주가 "발효 상태에 갇히”거나 "과발효되는" 결과로 나타납니다.
맥아과 맥주를 오염시키는 두 가지 주요한 미생물군이 있습니다. 
-    박테리아
-    야생 효모  
다음은 문헌으로 정리된 부패미생물에 대한 개요입니다(Bokulich 2013). 가장 흔히 접할 수 있는 맥주 부패미생물은 오염의 60-90%를 담당하는 것으로 보고된 유산균(주황색)과 함께 색상으로 강조 표시되었습니다.

Bokulich, N.A. and Bamforth, C.W. (2013) The Microbiology of Malting and Brewing. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 77, 157-172
 

맥주 맥아즙은 미생물학적인 배지로 간주될 수 있지만 맥주 자체는 에탄올(0.5-10%), 홉의 쓴맛을 내는 화합물, 특히 아이소 알파산(일반적으로 17-55ppm의 농도로 존재), 높은 C02 농도(0.5% w/v), 맥주를 혐기성 배지에 가깝게 만드는 극히 낮은 산소 함량(<0.1ppm), 극심하게 낮은 pH(대개 3.7-4.8 범위), 그리고 양조 효모를 사용한 발효 후 영양분이 고갈되었다는 사실은 말할 것도 없기 때문에 미생물학적으로 안정한 음료라고 보아야 합니다.
분류라는 측면에서 보면 그람 양성균이 가장 흔하게 관측되지만 일부 그람 음성균이 때때로 맥주 부패의 원인이 될 수도 있습니다.

그람 양성 박테리아(세포벽이 그람 염료의 보라색 염료를 유지[따라서 현미경 아래에서 파란색으로 나타남])는 일반적(잠재적 병원체를 포함해)으로 맥주에서 생존하지 못하지만, 일반적인 Lactobacillus 및 Pediococcus 속에 해당하는 흔히 유산균(LAB)이라고 불리는 특정한 박테리아는 맥주에서 생존할 수 있으며 가장 흔히 접할 수 있는 맥주 부패유발원입니다. 

유산균 – 아군 아니면 적?

아군: 일반적인 명칭에서 알 수 있듯 유산균은 아세트산보다 순하고 깨끗한 맛이 나는 젖산을 생산합니다. Berliner Weisse와 Gose와 같은 신맛이 나는 독일 밀 맥주는 이 종의 박테리아를 사용해 신맛을 내며, 당연하지만 이 박테리아는 람빅 발효에서도 발생합니다. 
적: 이 미생물은 전체 오염 사례의 60-90%의 원인이 되어, 가장 흔한 오염 문제로 간주됩니다(Back 2003). 이러한 맥주 부패 유발 종은 홉의 아이소 알파산에 대한 강한 내성[홉 내성 유전자 horA 및 horC의 존재로 표시]을 나타냅니다(Suzuki et al 2005).

LAB가 홉 내성 유전자를 보유하고 있는지 확인하는 것이 왜 중요합니까? 
horA 및 horC 유전자를 보유하고 있는 유산균과 그렇지 않은 유산균을 구별하는 능력은 최종적인 제품의 부패와 관련된 위험(예: 내성 유전자가 없는 박테리아는 소독이 필요하다는 지표에 가깝지만 내성 유전자 포함 박테리아는 품질에 있어 실질적인 위협이 됩니다) 수준을 측정할 수 있게 해 주기 때문에 양조업자와 품질 관리 관리자에게 있어 중요합니다. 현재 실질적으로 두 유산균의 구별은 양조장 연구소에서 PCR(중합효소 연쇄 반응) 기반 검사를 통해서만 가능합니다.

페트리 접시에서 맥주 부패 유발 LAB을 배양하는 것은 얼마나 쉽습니까?
LAB 배양의 용이성과 속도는 종종 품질 관리 검출 배지에서 변수로 관측되었으며, 이는 특히 맥주 부패 유발 LAB 균주가 주로 분리되게 되어 양조장에서 QC 검사를 통한 맥주 부패 유발 LAB의 검출 실패로 이어지게 됩니다(Suzuki 2012). 그 주된 이유 중 하나는 이러한 박테리아가 양조 환경에 적응하기 때문이며 이는 배양 배지 환경(예: 영양 프로필, pH)이 최적이 아님을 의미합니다.
 

그람 양성, 조건혐기성 또는 약호기성, 막대형의 포자를 형성하지 않는 박테리아입니다. 100종 이상의 유산균 중에서 맥주의 부패유발원로 인식되는 것은 13개 또는 14개뿐이며 가장 일반적으로 관측 가능한 유산균은 혼합발효성(즉, 당으로부터 알코올 또는 젖산을 생성할 수 있음)이고 30°C, pH 4-6에서 가장 잘 성장하는
Lactobacillus brevis입니다. Lactobacillus lindneri는 두 번째로 자주 관측되는 유산균으로, 홉 화합물에 대한 저항성이 높으며(Back, 1981) 19-23°C에서 가장 잘 성장하지만(Priest, 1987), 다른 유산균보다 더 높은 온도의 열 처리에서도 생존할 수 있습니다.

"맥주 부패유발원 lactobacilli균” 목록

Lactobacillus brevis, lindneri, buchneri, parabuchneri, casei, coryneformis, malefermentans, curvatus …   

                         
Lactobacilli는 양조 산업에 사용되는 많은 연구소 검출 배지에서 성장하기 어려운 경우가 많으며 미생물 품질 관리(QC)에 의해 검출되지 않고 부패 사례를 일으키는 경우가 많습니다. 이 박테리아는 스트레스(알코올, 낮은 pH, 홉 수지 등)에 노출되면 생존할 수 있지만 번식할 수 없는(VBNC) 휴면 상태가 되는 것으로 보고되었습니다.
또한, 이러한 박테리아는 전통적인 미생물학으로는 감지할 수 없지만 맥주에서의 생존성뿐만 아니라 이후 증식해 맥주를 변질시키는 능력 또한 결정하는 홉 내성 유전자(hor A 및 hor C)를 보유하거나 보유하지 않을 수 있습니다.
 

단일발효성(포도당을 전환하여 젖산을 생성)을 가지는 그람 양성, 조건혐기성 구균 박테리아입니다. 다만, 이 박테리아의 최종 대사 산물은 조건에 따라 달라지며, 일반적으로 맥주 부패 원인균으로서의 Pediococcus는 주요 부산물로 다이아세틸을 생성합니다. 

맥주 부패유발원 pediococci 목록

Pediococcus damnosus, acidilactici, pentosaceus, , parvulus, inopinatus, halophilus, dextrinicus, and urinaeequi.                                          

P. damnosus는 다소 낮은 온도에서 생장하며 최적 온도는 22-25°C입니다. 저온에서도 생장이 가능하기 때문에 병입된 제품은 물론 맥주 생산의 발효 및 숙성 단계에서도 부패가 발생할 수 있습니다.  Pediococcus 오염은 또한 박테리아가 효모 세포에 결합해서 제거하기 어렵다고 생각되어지고 있기 때문에 피칭 효모에서도 문제가 되고 있습니다.
또한, 이러한 박테리아는 전통적인 미생물학으로는 감지할 수 없지만 맥주에서의 생존성뿐만 아니라 이후 증식해 맥주를 변질시키는 능력 또한 결정하는 홉 내성 유전자(hor A 및 hor C)를 보유하거나 보유하지 않을 수 있습니다.

소수의 그람 음성 박테리아만이 맥주의 부패의 원인이 된다고 밝혀졌습니다. 이러한 박테리아는 두 가지 종류로 나뉩니다.
1) 상대적으로 가장 일반적으로 관측되는 - Pectinatus, Megasphaera 및 Zymophilus 속의 절대혐기성 박테리아 
2) 아세트산 박테리아(AAB), Zymomonas 및 특정 장내세균과 같은 그람 음성, 호기성 및 조건혐기성 박테리아가 포함됩니다.

절대 혐기성 세균: Pectinatus 및 Megasphaera 박테리아: 이 혐기성 그람 음성 세균은 유산균에 비해 맥주 부패 유기체로서는 훨씬 덜 자주 관측됩니다. 그러나 유산균과 달리 존재하는 경우 반드시 맥주 부패유발원으로 간주됩니다(Sakamoto and Konings, 2003). 즉, 만일 이 박테리아들이 확인되면 대처가 필요한 오염 상황이 존재하는 것입니다. 이 박테리아들은 눈에 띄는 문제를 일으키지 않고 양조장의 구석에 숨어들어 수 년 동안 생존할 수 있습니다(Hakalehto, 2000). 이후 이들은 몇몇 기술적 결함이나 부적합한 청소로 인해 맥주의 오염 및 부패를 유발할 수 있습니다.

아세트산 박테리아는 일반적으로 에탄올을 산화시켜 아세트산(식초)을 생성하므로 상업적인 식초 생산에 사용됩니다. 이 과에 속하는 그람 음성 박테리아(Acetobacteriaceae)는 약 10개의 속이 포함되며, 그 중 가장 흔한 것은 Acetobacter, Gluconobacter 및 Gluconacetobacter 속입니다. 
아세트산 박테리아는 특히 식물과 과일, 공기 중에 널리 분포되어 있으며, 산소가 있는 곳에서 유입되는 경우 맥주를 심하게 부패시킵니다. 산과 에탄올에 내성이 있고 홉 화합물에 의해 억제되지 않기 때문에 이 박테리아는 맥주에서 빠르게 성장하여 산성의 이취와 탁함을 초래합니다. 다만, 맥주를 적절하게 보관하고 산소 수치를 낮게 유지하는 한 아세트산 박테리아는 문제가 되지 않습니다. 그렇기 때문에 이 박테리아는 가장 일반적으로는 캐스크 숙성 맥주를 분배하는 동안에 문제가 됩니다.

이는 그람 음성 조건혐기성 박테리아의 하나의 큰 과입니다. Klebsiella, Citrobacter,  Obesumbacterium, 그리고 Hafnia와 같은 Enterobacteriaceae 과에 속하는 여러종이 발효되지 않거나 발효 중인 맥아즙의 부패와 관련이 있는 것으로 보고되었습니다. 이 박테리아는 48시간 이내에 35˚C - 37˚C에서 가스 및 산을 형성하며 유당을 이용할 수 있습니다. 이 박테리아는 일반적으로 완성된 맥주에서는 자랄 수 없지만, 때때로 양조 과정의 초기 단계에서 관측되어 최종 제품에서 원치 않은 이취를 유발합니다. 대장균군은 양조장의 위생 상태와 청결 수준을 나타내는 지표입니다.

정의상 야생 효모란 "의도적으로 사용되지 않았으며 완전히 통제되어 있지 않은" 효모이며 종종 환경에서 유입됩니다. 람빅 및 기타 자연 발효 맥주를 제외하고, 야생 효모는 양조 시 부패 유발 유기체로 간주되며 어떠한 경우에도 피해야 합니다. 모든 야생 효모가 맥주에 해를 끼치는 것은 아니지만 그럼에도 불구하고 이들의 존재는 양조장의 감염 및 위생 문제를 나타낸다는 점을 지적해야 합니다.
"야생 효모"를 논의할 때는 일반적으로 "Saccharomyces 효모" 및 "비Saccharomyces 효모 "로 논의됩니다.

비Saccharomyces 효모
- Brettanomyces /Dekkera 효모:
그리스어 Brettano(영국 양조업자)와 myces(곰팡이)에서 이름이 붙으 Brettanomyces속은 영국에서 1904년에 처음으로 분리되었습니다. Brettanomyces는 무성(비포자형성)형 종이고 Dekkera는 유성생식형 종입니다. 현재 5종의 Brettanomyces가 기록되어 있습니다.

Brettanomyces(Brett)는 높은 알코올 농도에 저항성을 가지며, 산소가 제한된 환경과 낮은 pH 환경에서도 자랄 수 있으므로 알코올 발효 환경에서 번성할 수 있습니다. 또한 호기성 조건 하에서 당을 발효시킬 수 있으며(Crabtree 효과로 알려짐) 호기성 조건에서 아세트산을 생성할 수 있는 능력을 통해 다른 미생물과의 경쟁에서 우위를 점하는 추가적인 전략을 사용합니다. Brett는 또한 특정한 발효 조건 하에서의 경쟁에서 S. cerevisiae를 뛰어넘을 수 있습니다. Brett는 맥아당과 과당은 물론 포도당과 심지어 S. cerevisiae가 잘 사용하지 않는 셀로비오스와 덱스트린과 같은 복합당을 포함한 광범위한 탄소원을 대사할 수 있어 알코올 농도가 높고 당 함유량이 낮은 “초발효된” 맥주가 만들어지게 됩니다. 

다른 비Saccharomyces 효모는 맥주에서 성장할 수 있으며 간혹 관찰됩니다(예: Pichia spp, Candida spp, Torulaspora delbrueckii 및 Zygosaccharomyces…)

일반적으로 이 효모들의 부패 유발 능력은 제한된 산소, 에탄올의 독성 및 Saccharomyces와의 영양소 경쟁으로 인해 최적의 조건 하에서는 제한됩니다. 이러한 효모의 대부분은 양조장 전체, 특히 더러운 샘플링 포트 및 맥주와 접촉하는 다른 표면에서 검출할 수 있습니다. 이 효모는 이취(특히 유기산과 POF), 탁함, 침전물, 또는 맥주 표면에 막을 생성합니다. 이러한 효모들은 좋은 조건 하에서 부패를 일으키는 기회 오염 물질로 간주되어야 하지만 일반적으로 현대적인 양조 관행에서는 문제가 되지 않습니다. 이 효모는 산소 유입이 성장을 자극하는 배럴 발효 맥주에서 더 문제가 되기 때문에, 배럴 숙성 과정에서 여유공간의 크기를 제한해야 합니다. 

야생 Saccharomyces 효모
의도한 것과 다른 종의 S. cerevisiae 균주와의 교차오염은 비정상적인 발효 성능뿐만 아니라 저하된 풍미로 이어질 수 있습니다. 가장 많이 언급되고 문제가 되는 Saccharomyces 야생 효모는 Saccharomyces diastaticus로, 몇 년 전부터 부패유발원으로 등장하여 전 세계의 양조장 업계에서 발견되었습니다.
 

야생 Saccharomyces 효모
의도한 것과 다른 종의 S. cerevisiae 균주와의 교차오염은 비정상적인 발효 성능뿐만 아니라 저하된 풍미로 이어질 수 있습니다. 가장 많이 언급되고 문제가 되는 Saccharomyces 야생 효모는 Saccharomyces diastaticus로, 몇 년 전부터 부패유발원으로 등장하여 전 세계의 양조장 업계에서 발견되었습니다.

Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus는 이름에서 알 수 있듯이  STA(1, 2 또는 3) 유전자를 보유하고 있는 S. cerevisiae의 변종입니다 . 이 유전자는 효모가 더 복잡한 탄수화물, 특히 덱스트린을 단순당으로 가수분해할 수 있도록 하는 글루코아밀레이스라는 효소를 생성하도록 하여 과발효를 유발합니다. 이는 일반적으로 다음과 같은 결과를 낳습니다.
-    과발효(> 90%) 혹은 2차 발효 
-    과탄산화(병/캔/통을 여는 순간 "분출"이 일어나는 것을 통해 관찰됨)
-    비정상적인 맛
diastaticus의 가능한 원인:
• 불량한 위생:
- 병입/캔 주입 공장에서(보고된 사례 중 >70%) [Meier-Dörnberg 2017]
- 양조장
- 발효 탱크
- 저장 구역
• 원료:
- 효모
- 홉(예: 드라이 홉핑)

NB. 일부 diastaticus 효모는 복잡하면서도 흥미로운 맥주를 생산하는 데 사용할 수 있으며 "세종 스타일"의 맥주가 그 완벽한 예시입니다. 양조장에서 이러한 효모를 취급하려면 교차 오염을 방지하기 위해 주의와 신중히 계획된 품질 관리 계획이 필요합니다.

• 유산균 [LAB](lactobacilli 및 pediococci)은 "맥주 부패유발원" 문제의 60-90%를 차지합니다.
• 100종 이상의 유산균이 존재하지만 오늘날 "맥주 부패유발원"로 인정되는 lactobacilli는 14종 정도에 불과합니다.
• 맥주 환경에 대한 탁월한 적응성 때문에 LAB는 QC 배지에서 배양하는 것이 어렵고 느리며(2-4일), 위음성 결과를 얻게 될 위험이 있습니다.
• LAB에 있는 hop 저항 유전자 hor A 및 hor C의 존재는 위험 관리에 대한 신뢰할 수 있는 지표로 인식되며 PCR 검사법을 통해서만 검출할 수 있습니다.
• 혐기성 박테리아(Megasphaera spp. 및 Pectinatus spp.)는 일반적으로 알코올 < 5%인 맥주와 매우 낮은 산소 조건에서만 발견됩니다. 다만, 존재하는 경우 이 박테리아는 반드시 부패유발원으로 간주됩니다.
• Saccharomyces var diastaticus는 원치 않는 2차 발효로 인한 "분출"의 가장 흔한 원인균입니다. 오염원은 주로 효모 그 자체 또는 일단 한 번 자리를 잡은 경우 양조장 자체에서 발생할 수 있습니다.
• "야생 효모"(예: Brettanomyces/Dekkera)는 높은 알코올 농도에 저항성이 있고 산소가 제한된 환경과 낮은 pH 환경 모두에서 자라기 때문에 맥주에서 번성할 수 있어 문제가 됩니다.