6부 - PCR을 이용한 맥주 부패 미생물 검출에 대한 설명

모든 맥주 부패를 일으키는 미생물은 생물의 발달과 기능에 대한 유전적인 명령이 포함되어 있는 DNA(디옥시리보핵산)를 가지고 있습니다. 동물, 식물, 그리고 효모에서는 DNA가 세포핵에 들어 있지만, 박테리아의 DNA는 세포질(세포막으로 둘러싸인 세포 안의 물질)에 존재합니다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 미국의 생화학자 Kary Mullis에 의해 1983년에 발명된 간단하고 아름다운 시험방법입니다. 그녀가 자신의 문헌(1990)에서 설명했듯이 이 방법은 "관심 있는 DNA 조각을 선택해서 원하는 만큼 얻을 수 있는” 분석법입니다. PCR을 사용해 기존의 연구소에서의 시험방법을 사용하여 분석하기에 충분한 양의 복제된 DNA를 만드는 데는 미량의 DNA만이 필요합니다. 그렇기에, PCR은 민감한 분석법입니다.

PCR은 오늘날 분자생물학에서 널리 사용되는 방법이며, 5년 전만 해도 장비와 특정 멸균 연구소 조건을 갖추는 데 필요한 투자로 인해 대규모 중앙 연구소와 연구기관에서만 볼 수 있는 기술로 여겨졌던 기술이었습니다. 최근에는 PCR의 절차 및 장비(열순환기)가 단순화되어 PCR 기술이 “범용화”되었기 때문에 양조장 및 식품 생산 체인 전반에 걸쳐 현장에서 실제 생산 도구로 사용될 수 있게 되었습니다.

DNA 속의 정보는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T)의 네 가지 염기로 구성된 코드 형태로 저장됩니다. DNA 염기는 A와 T, C와 G가 서로 짝을 이루어 염기쌍이라고 하는 하나의 단위를 형성합니다. 각 염기는 당 분자와 인산염 분자와도 결합합니다. 염기, 당, 인산염을 모두 합쳐서 뉴클레오타이드라고 합니다. 뉴클레오타이드는 두 개의 긴 가닥이 나선 형태를 형성한 모양으로 정렬되는데, 이를 이중나선이라고 합니다.

DNA의 중요한 특성은 자기 자신을 복제, 즉 사본을 만들 수 있다는 것입니다. 이중 나선의 각 DNA 가닥은 염기서열을 복제하기 위한 패턴의 역할을 할 수 있습니다.

1. 박테리아 또는 효모의 DNA 유리 
샘플을 원심분리하여 "맥주 부패유발원 세포"를 농축하고, 완충제를 넣어 세포벽을 분해합니다.

2. 그 뒤, 맥주 부패유발원의 DNA를 반응(DNA 복제)에 필요한 모든 요소를 ​​포함하고 있는 PCR의 "마스터 믹스 용액"에 첨가하고 열순환기에 넣습니다.
 

3. 높은 온도를 가하여 두 DNA 가닥을 분리(변성)한 다음 온도를 낮추면 "맥주 부패유발원 특이적 프라이머"가 해당하는 DNA 코드를 찾아 그 반대쪽에 나열되게 됩니다(결합).

4. 프라이머가 제자리를 찾았다면 효소(중합 효소)는 새로운 이중 가닥을 생성(연장)하기 위해 새로운 가닥의 합성을 어디서 시작하고 완료해야 하는지 알게 됩니다.
이렇게 1개의 가닥은 주기가 한 번 완료된 이후 2개가 됩니다. 그런 다음 "열순환기"에서 이 과정을 반복합니다.

각 PCR 주기가 끝날 때마다 새로 합성된 DNA 서열을 템플릿으로 사용할 수 있(원래 DNA 템플릿에 더불어서)기 때문에 PCR의 산물, 혹은 앰플리콘의 수는 기하급수적으로 증가하게 됩니다. 일반적으로 DNA 조각을 10⁶배에서 10⁹배 증폭한다고 한다면 일반 PCR 주기를 20-30회 시행하는 것만으로도 충분합니다.

5. PCR 합성 앰플리콘의 판독은 2가지 방식으로 이루어질 수 있습니다!

a) 실시간 PCR(qRT-PCR)는 특정 DNA 서열(맥주 부패유발원의 존재)의 초기 양이 높거나 낮을수록 앰플리콘 농도가 각각 더 높아지거나 낮아진다는 원리를 기반으로 합니다. 앰플리콘은 합성될 때 레이저 또는 광학 판독기로 “읽어”낼 수 있는 형광 마커로 태깅됩니다. 열순환기의 소프트웨어가 이를 해석해 앰플리콘의 농도를 유추합니다. 

결과는 대개 샘플의 반응 곡선이 사전설정된 임계값 선과 만나는 PCR 주기 번호인 Ct값으로 표현됩니다. 이 값은 샘플에서 실제 신호가 감지되는 데 몇 번의 주기가 필요했는지 알려줍니다. 결과의 해석은 대개 어려우며, "맥주 부패유발원" 존재 위험이 있는지 여부를 확실하게 말할 수 있게 되기까지는 경험이 필요합니다.

b) 빠른 결과 해석을 포함한 최종 단계 PCR 또한 qRT-PCR 기반 방법과 마찬가지로 특정 DNA 서열(맥주 부패유발원의 존재)의 초기 양이 높거나 낮을수록 앰플리콘 농도가 각각 더 높아지거나 낮아진다는 원리를 기반으로 합니다. 차이점은 고정된 수의 주기가 시행되고 각 앰플리콘이 합성될 때 형광 마커 대신 바이오마커가 부착되어 이후 신속 검사에 존재하는 특정한 "항체"에 의해 검출된다는 것입니다. "임신 테스트"와 마찬가지로 결과는 시각적으로 표시되며, 유/무 뿐만 아니라 존재 시에도 선이 얼마나 명확하게 나타나는지를 “표준” 스코어카드에 대해 측정하여 최초에 존재했던 "맥주 부패유발원 세포"의 반정량적인 수준을 얻을 수 있습니다.

위에서 언급했듯이 PCR 기술은 빠르고, 민감하며, 특이적이어서 양조장의 연구소에 사용하기 이상적인 도구이지만, 이 방법은 살아 있는 세포와 죽은 세포의 DNA를 구별할 수 없습니다. PCR에 있어서 DNA는 DNA일 뿐입니다. 많은 수제 양조장의 경우 이는 문제가 되지 않지만, 맥주를 저온 멸균하는 수제 및 산업 양조장의 경우 저온 멸균법(즉, 병입 전 또는 완제품)을 적용한 이후 PCR 검사를 할 경우 QC 관리자는 샘플의 “양성” 반응에 골머리를 앓게 될 수도 있습니다.

이 양성 반응은 저온멸균에서 살아남은 세균에서 온 것이어서 완제품의 품질에 위협이 되는가? 아니면 단순히 세포가 사멸된 후 남은 DNA에 불구해서 이전 공정에서 문제가 있다는 것을 QC 관리자에게 알리는 역할을 하지만 유통기한 동안 맥주의 품질에는 더 이상 위협이 되지 않는가?

일부 경우에 PCR 제조업체는 분석 전에 죽은 세포 DNA가 존재하는 경우 농축 과정 도중에 희석되고 DNA 수가 농축 과정 도중에는 분명히 증가하지 않을 최소 24시간의 "멸균 후" 농축 단계를 도입할 수도 있습니다. 이 경우에도 농축 후의 PCR 결과는 저온멸균 전의 오염 수준과 다양한 맥주의 변수(예: pH, 온도 등)에 따라 달라지는 유리된 DNA가 손상되지 않은 상태로 유지되는 시간에 따라 달라지게 됩니다. 따라서 소위 말하는 “거짓” 양성은 여전히 ​​발생할 수 있습니다.

또 다른 접근법은 DNA를 DNA에 대한 높은 친화성을 가지며 이와 결합하지만 증폭 전에 생존한 세포의 세포벽을 통과해 내부의 DNA에 접근할 수는 없는 분자(예: PMAxx ^TM - Biotium, Inc.)에 노출시키는 것이 있습니다. 일단 결합한 뒤 특정 광 파장에 노출되면 "고정된" DNA는 PCR의 증폭 단계 동안 증식할 수 없습니다. 최종적인 결과는 "양성"이 관찰되는 경우 그것이 살아있는 세포에서 나온 것이라는 사실을 알 수 있다는 것입니다!

• 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 관심 대상인 맥주 부패유발원의 특정 DNA 코드 서열의 감지에 있어서는 매우 특이적이고 민감합니다 
• 지난 5년 동안 PCR에 프로토콜 단순화 및 장비 비용의 감소를 통한 범용화가 이루어졌습니다.
• 오늘날 PCR은 당일 결과를 얻을 수 있는 능력 덕분에 진정한 "생산지향적인" 도구로 간주됩니다.
• PCR 기술에는 2가지 접근 방식이 있습니다.(1) 최종단계 PCR: 고정된 수의 주기 동안 선택된 DNA 조각을 증폭한 다음 분석(2) RT-PCR : 증폭 과정의 각 주기 이후 존재하는 DNA의 실시간 분석
• PCR은 플랫폼에 따라 정성적 및 정량적 결과를 모두 얻을 수 있습니다.
• PCR을 사용하는 저온 멸균 맥주의 QC는 생존 세포에 대한 "위양성"의 가능성을 피하기 위해 추가적인 단계가 필요합니다.