PARTE 6 - Explicação da detecção de deterioração da cerveja por PCR

Todos os microrganismos deteriorantes de cerveja possuem DNA (ácido desoxirribonucleico) que contém as instruções genéticas para o desenvolvimento e função dos organismos vivos. Enquanto nos animais, plantas e leveduras o DNA está contido no núcleo da célula, nas bactérias o DNA está presente no seu citoplasma (o material interno à célula, delimitado pela membrana celular).

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um teste simples e elegante inventado em 1983 pelo bioquímico americano Kary Mullis. Como descrito por ele na sua publicação (1990), ela "permite escolher o pedaço de DNA que te interessa e ter a quantidade que quiser". São necessárias apenas quantidades ínfimas de DNA para o PCR gerar cópias suficientes para serem analisadas utilizando métodos laboratoriais convencionais. Por esta razão, o PCR é um teste sensível.

Hoje em dia é um método amplamente utilizado em biologia molecular. Embora há 5 anos ainda fosse considerada uma tecnologia que só poderia ser encontrada em grandes laboratórios centrais e institutos de pesquisa devido ao investimento necessário, tanto em equipamento como em condições laboratoriais específicas. Mais recentemente, houve significativa simplificação de protocolos e equipamentos de PCR (termocicladores) que permite uma "democratização" da tecnologia PCR para sua utilização local como uma verdadeira ferramenta de produção, na cervejaria e ao longo de toda a cadeia de produção alimentar.

 No DNA, a informação é armazenada como um código composto por quatro bases químicas: adenina (A), guanina (G), citosina (C), e timina (T). As bases de DNA emparelham-se entre si, A com T e C com G, para formar unidades chamadas pares de bases. Cada base está também ligada a uma molécula de açúcar e a uma molécula de fosfato. Juntas, uma base, açúcar e fosfato são chamadas de nucleotídeos. Os nucleotídeos estão dispostos em dois longos filamentos que formam uma espiral chamada dupla hélice.

Uma propriedade importante do DNA é que ele pode replicar-se ou fazer cópias de si mesmo. Cada filamento de DNA na dupla hélice pode servir como modelo para guiar a duplicação da sequência de bases.

1. Separando o DNA de bactérias ou leveduras 
A amostra é centrifugada para concentrar as células de deteriorantes antes de se adicionar um tampão para quebrar a parede celular

2. O DNA do deteriorante é então adicionado à "solução master mix" de PCR que contém todos os elementos necessários para a reação (replicação do DNA) e então é colocado num termociclador.
 

3. É aplicada uma alta temperatura para separar os 2 filamentos de DNA (Desnaturação) e, a seguir, a redução da temperatura permite que os "adaptadores específicos para o deteriorante" (primers) procurem o código de DNA correspondente e alinhem-se em frente a eles (Anelamento).

4. Quando os primers estão em posição, a enzima (Polimerase) sabe por onde começar e terminar a síntese de uma nova fita para criar uma nova dupla fita (Extensão).
E assim, 1 cadeia passa a ser 2 após um ciclo completo. Os ciclos são então repetidos no "Termociclador"

No final de cada ciclo de PCR, o produto PCR ou amplicon aumentará exponencialmente porque as sequências de DNA recém sintetizadas podem ser utilizadas como modelo (somando-se ao modelo original de DNA). Normalmente, 20 a 30 ciclos de PCR são suficientes para alcançar um aumento de 10⁶  a 10⁹ dos fragmentos de ADN.

5. A leitura dos amplicons sintetizados por PCR pode acontecer de 2 modos!

a) A PCR quantitativa em tempo real ( qRT-PCR) baseia-se no princípio de que quantidades iniciais mais altas ou mais baixas de uma determinada sequência de DNA (presença de deteriorante de cerveja) levarão a concentrações mais altas ou mais baixas de amplicons, respectivamente. À medida que os amplicons são sintetizados, são incorporam um marcador por fluorescência que pode depois ser "lido" por um leitor a laser ou óptico e interpretado de acordo com o softwares que inferem a concentração dos amplicons. 

O resultado é frequentemente expresso como um valor Ct (ciclo limite) que é o número do ciclo de PCR no qual a curva da reação de uma amostra cruza um limiar previamente estabelecido. Este valor indica quantos ciclos foram necessários para detectar um sinal genuíno das suas amostras. A interpretação dos resultados pode muitas vezes ser difícil e requerer experiência para dizer com segurança se existe ou não um risco de presença de um deteriorante.

b) O PCR em endpoint (ponto final) a leitura de teste rápido baseia-se, de forma similar ao qRT-PCR, no princípio de que quantidades iniciais mais altas ou mais baixas de uma sequência específica de DNA (presença de deteriorante) conduzirão a concentrações mais altas ou mais baixas de amplicons, respectivamente. A diferença é que se realiza um número fixo de ciclos e quando cada amplicon é sintetizado, em vez de ser etiquetado com um marcador por fluorescência, liga-se a ele um biomarcador que será depois detectado por um "anticorpo" específico, presente em um teste rápido. Assim como com um "teste de gravidez", o resultado não é apenas visível com presença/ausência, mas quando presente, a intensidade da linha pode ser medida em comparação com um quadro "padrão" para determinar o valor semiquantitativo de células de deteriorantes de cerveja originalmente presentes.

Embora, como mencionado acima, a tecnologia PCR seja rápida, sensível e específica, tornando-a uma ferramenta ideal para o laboratório da cervejaria, não é capaz de diferenciar o DNA proveniente de células vivas daquele de células mortas. Para o PCR, DNA é simplesmente DNA! Para muitas cervejarias artesanais isto não é um problema, contudo para aquelas que pasteurizam a sua cerveja, a utilização de PCR após a pasteurização (isto é, antes do engarrafamento ou do produto final) pode deixar os gestores de CQ um tanto perplexos quando obtêm um resultado positivo numa amostra.

Ele é proveniente de células vivas que sobreviveram à pasteurização e, portanto, impõem um risco para a qualidade do produto acabado ou é simplesmente o DNA remanescente após a célula ter sido morta e, embora alerte o gestor de CQ para um problema anterior, ele já não representa uma ameaça para a qualidade da cerveja durante o seu prazo de validade?

Em alguns casos, o fornecedor do PCR irá propor uma etapa de enriquecimento "pós-pasteurização" de pelo menos 24 horas antes da análise para que, caso o DNA das células mortas estiver presente, seja diluído durante o enriquecimento e obviamente não aumente durante o enriquecimento. O resultado do PCR após o enriquecimento depende, no entanto, do nível de contaminação antes da pasteurização e do tempo que o DNA liberado permanece intacto, o que dependerá de muitas variáveis diferentes da cerveja (por exemplo, pH, temperatura ...). Os chamados "falsos" positivos ainda são possíveis.

Outra abordagem é expor o DNA a uma molécula (por exemplo, PMAxx ^TM - Biotium, Inc.) que tem uma grande afinidade ao ácido nucleico e se liga a ele, mas que é incapaz de atravessar uma célula viável para acessar seu  DNA antes da amplificação. Uma vez ligado e exposto a luz de um determinado comprimento de onda , o DNA "ligado" não pode ser amplificado no PCR. O resultado final é que, se for observado um resultado positivo, sabe-se que provém apenas de células vivas e viáveis!

• A tecnologia de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), é muito específica e sensível devido à virtude de detectar sequências específicas de DNA para os deteriorantes de cerveja
• Nos últimos 5 anos, o PCR foi democratizada por meio da simplificação de protocolos e da redução dos custos de investimento para o sistema.
• Atualmente, o PCR é considerado uma verdadeira ferramenta "para a produção", devido à sua capacidade de fornecer resultados no mesmo dia.
• Existem 2 abordagens à tecnologia PCR - (1) PCR endpoint (de fase final): amplificação do segmento de DNA selecionado para um número fixo de ciclos e análise subsequente do resultado. (2) qPCR: durante o processo de amplificação, análise em Tempo Real de DNA presente ciclo após ciclo.
• PCR permite tanto resultados qualitativos como quantitativos, dependendo da plataforma
• O CQ de cervejas pasteurizadas utilizando PCR requer um passo adicional para evitar a possibilidade de "falsos positivos"