PARTE 7 - Detecção de Lactobacillus, S. cerevisiae var. diastaticus, Pediococcus, Pectinatus, Megasphaera, ... na cerveja: Como montar um laboratório de microbiologia?

A sua cervejaria está funcionando bem e com uma demanda crescente. Como garantir a consistência da qualidade e do sabor e de seu produto à medida em que a pressão de produção aumenta? Ao lado dos parâmetros fisico-químicos, normalmente já monitorados, estabelecer uma unidade de controle de qualidade de microbiologia no seu laboratório é fundamental para responder a estas questões.

Primeiros passos 
Quase sempre, a maior incerteza para qualquer cervejaria (qualquer que seja o seu tamanho) é por onde começar. As primeiras decisões importantes a serem tomadas são:
- O objetivo do seu laboratório de microbiologia
- Mapear a mão-de-obra necessária para o funcionamento do laboratório
- O seu orçamento para a instalação do laboratório de microbiologia. 
Ao construir o seu primeiro laboratório ou ao expandir um laboratório já existente, cada cervejaria deve se planejar para funções críticas relacionadas ao laboratório:

Recomenda-se controlar e medir concentração e a viabilidade de leveduras para determinar a taxa de inóculo e para compreender a saúde das leveduras durante a fermentação. Essencialmente, o conceito é utilizar um microscópio (capacidade de 100 x e 400 x de ampliação), uma câmara de contagem tipo Neubauer e alguma coloração de viabilidade para visualizar a sua levedura; então realizar contagens de células para calcular a taxa de inóculo, e obter os dados de viabilidade. Este simples procedimento de rotina contribuirá para melhorar a consistência das fermentações.

Muitas vezes, a forma mais rápida e fácil de iniciar um laboratório na cervejaria é monitorar as bactérias acidoláticas (Lactobacillus e Pediococcus) - os dois micro-organismos deteriorantes mais comuns da cervejaria. Finalmente, a questão de S. cerevisiae var. diastaticus também é de interesse para as cervejarias, uma vez que pode causar uma atenuação excessiva no sabor, além do transbordamento de espuma embarris, garrafas e latas.
A detecção de microrganismos pode ser feita de diferentes maneiras:

Microbiologia tradicional

Como o nome sugere, esta técnica primária baseia-se na capacidade de crescimento dos microrganismos, que muitas vezes varia entre 2-4 dias para as bactérias e 5-10 dias para as leveduras. Para um desempenho correto, o técnico deve ser capacitado para realizar os métodos microbiológicos básicos, para garantir que a amostra é manuseada corretamente e para evitar a contaminação cruzada. Também deve ter conhecimento sobre os requisitos de manuseio, controle de qualidade e estocagem dos meios de cultura (tanto em formato pronto para uso como desidratado). Finalmente, a interpretação dos resultados deve ser correta e significativa em termos do que a cervejaria e/ou o gestor de controle de qualidade devem saber. Cultivar uma colônia é uma coisa, compreender a sua relevância para a produção e o impacto para a qualidade da cerveja é outra (apesar do que certas soluções afirmam!!) 

- Preparo de meios de cultura / Técnicas de assepsia para o plaqueamento / Técnicas de manejo de cepas de controle de qualidade / Técnicas de coloração (por exemplo, coloração de Gram) e técnicas de identificação.

Independentemente da técnica tradicional de microbiologia, são necessários alguns itens básicos
- Bico de Bunsen ou equivalente
- Estufa
- (gerador de CO2 para o caso de incubação anaeróbica)    

Método de plaqueamento em superfície:
- Placa/tubo de meios de cultura estéreis + meios de cultura sólidos estéreis
- Pipeta graduada estéril de 1ml + alça de Drigalski ou alça microbiológica

Método de filtração por membranas:
- Manifold (incluindo copos de filtração)
- Bomba de vácuo
- Filtro de membrana (tamanho do poro de 0,45µm)

Necessidade de equipamentos para identificar isolados 
- Capacidade para realizar coloração de Gram (lâminas, kit de coloração de Gram, microscópio)
- Capacidade de realizar testes de orientação básica (por exemplo, teste de catalase)
- Capacidade de realizar testes bioquímicos padronizados (por exemplo, testes de fermentação de açúcar)

Análise por PCR
A análise por PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) é uma técnica moderna que analisa um segmento do DNA do micro-organismo alvo, com o objetivo de detectar a sua presença. Durante a amplificação, o DNA de interesse é copiado repetidamente até que haja material suficiente para análise e detecção. Nos últimos 5 anos, esta técnica foi simplificada de tal forma que agora é frequentemente empregada em laboratórios de cervejarias sem a necessidade de formação microbiológica especializada ou de ambiente específico como salas estéreis, que anteriormente eram indicadas para evitar a contaminação cruzada. A boa notícia é que o PCR provê resultados em poucas horas, é muito específico, sensível, e geralmente requer esforço mínimo do operador, dependendo do sistema.

Equipamentos necessários:
- Centrífuga
- Termociclador
- Pipetas e ponteiras
 

Uma parte importante do programa de controle de qualidade de cada cervejaria. Além da temperatura, um dos aspectos mais importantes para uma fermentação bem sucedida é o Oxigênio Dissolvido (OD). A levedura precisa de oxigênio para gerar os lipídios necessários ao seu crescimento e funcionamento ótimos. Assegurar o fornecimento de oxigênio adequado ao mosto é, contudo, um desafio. A dissolução de oxigênio em meio aquoso depende muito de fatores que não são estáveis, como a temperatura e densidade do mosto e como a pressão hidrostática no tanque. O oxigênio também deixa a solução com bastante facilidade, portanto, prover oxigênio na hora e no local certos é muito importante.

Uma vez que se tenha a fermentação sob controle, monitore o seu desempenho para identificar e corrigir problemas antecipadamente. Isso envolve desde o simples seguimento e manutenção de registros de indicadores chave para cerveja (por exemplo, densitometria e pH) até ser capaz de identificar desvios ao comportamento normal das leveduras. Existem softwares que podem ajudá-lo com isso.

Muitas vezes negligenciada, esta medida simples permite a uma cervejaria controlar a estabilidade durante o tempo de prateleira cerveja. Idealmente, deveriam ser reservados dois espaços de amostragem na cervejaria, um à temperatura ambiente e outro sob refrigeração. Além da contaminação microbiana, estas amostras também poderiam ser utilizadas para outros testes, tais como pH, CO2 e testes sensoriais.

Aconselha-se reter de 6 a 10 garrafas de cada lote. O armazenamento da cerveja pode ser utilizado para definir e melhorar seu prazo de validade e antecipar-se para gerenciar quaisquer problemas que eventualmente surjam no mercado

• É importante estabelecer desde o início os seus objetivos para o laboratório de microbiologia
• É necessário ter um espaço reservado, pessoa(s) devidamente treinada(s) e um orçamento que viabilize a operação.
• Duas atividades microbiológicas importantes
    - Gestão de leveduras
    - Detecção de deteriorantes
• É essencial investir no equipamento correto de acordo com os testes microbiológicos a serem realizados
• Controle de qualidade microbiológica : Duas tecnologias a serem consideradas
    - Microbiologia tradicional
    - Microbiologia rápida por PCR
• Importante ter um espaço reservado para a retenção de garrafas de diferentes lotes de produção durante o seu período de validade para propósitos de garantia de qualidade