TEIL 6 - PCR-Nachweis von Bier-schädlingen erklärt

Alle bierschädlichen Mikroorganismen besitzen DNS (Desoxyribonukleinsäure), die die genetischen Anweisungen für die Entwicklung und Funktion von Lebewesen enthält. Während die DNS bei Tieren, Pflanzen und Hefen  im Zellkern enthalten ist, befindet sie sich bei Bakterien in deren Zytoplasma (das von der Zellmembran umschlossene Material innerhalb einer Zelle).

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein einfacher und eleganter Test, der 1983 von der amerikanischen Biochemikerin Kary Mullis erfunden wurde. Wie sie in ihrer Veröffentlichung (1990) darlegte: „Sie können sich das Stück DNS aussuchen, das Sie interessiert, und so viel davon haben, wie Sie wollen.“ Für die PCR werden nur Spuren von DNS benötigt, um genügend Kopien zu erzeugen, die mit herkömmlichen Labormethoden analysiert werden können. Aus diesem Grund ist der PCR-Test empfindlich.

Heute ist sie eine in der Molekularbiologie weit verbreitete Methode. Obwohl sie vor 5 Jahren noch als eine Technologie galt, die aufgrund der notwendigen Investitionen sowohl in die Ausrüstung als auch in die spezifischen sterilen Laborbedingungen nur in den großen Zentrallabors und Forschungsinstituten zu finden war, hat in jüngerer Zeit eine Vereinfachung der PCR-Protokolle und der Ausrüstung (Thermocyler) stattgefunden, die eine „Demokratisierung“ der PCR-Technologie ermöglicht, so dass sie als echtes Produktionswerkzeug vor Ort in der Brauerei und in der gesamten Lebensmittelproduktionskette eingesetzt werden kann.

Die Informationen in der DNS sind als Code gespeichert, der aus vier chemischen Basen besteht: Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). DNS-Basen paaren sich miteinander, A mit T und C mit G, um Einheiten zu bilden, die Basenpaare genannt werden. Jede Base ist auch an ein Zuckermolekül und ein Phosphatmolekül gebunden. Zusammen werden eine Base, ein Zucker und ein Phosphat als Nukleotid bezeichnet. Nukleotide sind in zwei langen Strängen angeordnet, die eine Spirale bilden, die Doppelhelix genannt wird.

Eine wichtige Eigenschaft der DNS ist, dass sie sich replizieren kann, also Kopien von sich selbst anfertigt. Jeder DNS-Strang in der Doppelhelix kann als Muster für die Vervielfältigung der Basenfolge dienen.

1. Befreien Sie die DNS von Bakterien oder Hefe 
Probe wird zentrifugiert, um „bierschädliche Keime“ zu konzentrieren, bevor ein Puffer zum Abbau der Zellwand zugegeben wird

2. Die bierschädliche DNS wird dann in die PCR-„Mastermix-Lösung“ gegeben, die alle notwendigen Elemente für die Reaktion (Replikation der DNA) enthält, und in einen Thermocycler gegeben.
 

3. Eine hohe Temperatur wird angewendet, um die 2 DNS-Stränge zu trennen (Denaturierung). Dann wird die Temperatur gesenkt, damit die „bierschädlichen spezifischen Primer“ ihren entsprechenden DNS-Code suchen und sich gegenüber anordnen können (Annealing).

4. Wenn die Primer in Position sind, weiß das Enzym (Polymerase-Enzym), wo es seine Synthese eines neuen Strangs beginnen und beenden muss, um einen neuen Doppelstrang (Extension) zu erzeugen.
Und so werden aus 1 Strang nach einem vollen Zyklus 2. Die Zyklen werden dann im „Thermocycler“ wiederholt

Am Ende jedes PCR-Zyklus wächst das PCR-Produkt oder Amplifikat exponentiell an, da die neu synthetisierten DNS-Sequenzen als Vorlagen (zusätzlich zur ursprünglichen DNS-Vorlage) verwendet werden können. Üblicherweise reichen 20 bis 30 Standard-PCR-Zyklen aus, um einen Zuwachs von10⁶  bis 10⁹ der DNS-Fragmente zu erreichen.

5. Das Auslesen der von der PCR synthetisierten Amplifikate kann auf 2 Arten erfolgen!

A) Die Echtzeit-PCR ( qRT-PCR) beruht auf dem Prinzip, dass höhere oder niedrigere Ausgangsmengen einer bestimmten DNS-Sequenz (Präsenz von Bierkeimen) zu höheren bzw. niedrigeren Konzentrationen von Amplifikaten führen. Während der Synthese der Amplifikate werden diese mit einem Fluoreszenzmarker versehen, der dann von einem Laser oder einem optischen Lesegerät „gelesen“ und entsprechend der Software des Thermocyclers interpretiert werden kann, um auf die Konzentration des Amplifikats zu schließen. 

Das Ergebnis wird oft als Ct-Wert ausgedrückt, der die PCR-Zykluszahl darstellt, bei der die Reaktionskurve Ihrer Probe einen vorher festgelegten Schwellenwert schneidet. Dieser Wert gibt an, wie viele Zyklen es dauerte, bis ein echtes Signal von Ihren Proben erfasst wurde. Die Interpretation der Ergebnisse kann oft schwierig sein und erfordert Erfahrung, um zuverlässig sagen zu können, ob ein Risiko für die Präsenz von „Bierkeimen“ besteht oder nicht.

b) Die terminale PCR mit Schnelltestablesung beruht ebenfalls, wie die qRT-PCR, auf dem Prinzip, dass höhere oder niedrigere Ausgangsmengen einer bestimmten DNS-Sequenz (Präsenz von Bierkeimen) zu höheren bzw. niedrigeren Konzentrationen von Amplifikaten führen. Der Unterschied besteht darin, dass eine feste Anzahl von Cyclern durchgeführt wird und bei der Synthese jedes Amplifikats anstelle eines Fluoreszenzmarkers ein Biomarker angehängt wird, der dann von einem spezifischen „Antikörper“, der auf einem Schnelltest vorhanden ist, nachgewiesen wird. Wie bei einem „Schwangerschaftstest“ ist das Ergebnis nicht nur mit Vorhandensein/Abwesenheit sichtbar. Aber auch wenn vorhanden, kann der Grad der Linienstärke anhand einer „Standard“-Punktekarte gemessen werden, um den halbquantitativen Wert der ursprünglich vorhandenen „bierschädlichen Keime“ zu ermitteln.

Obwohl die PCR-Technologie, wie oben erwähnt, schnell, empfindlich und spezifisch ist und damit ein ideales Werkzeug für das Brauereilabor darstellt, kann sie DNS von lebenden Zellen nicht von derjenigen aus toten Zellen unterscheiden. Für die PCR ist DNS einfach DNS. Für viele Craftbier-Brauereien ist dies kein Problem, aber für die Craftbier- und Industriebrauereien, die ihr Bier pasteurisieren, kann die Verwendung der PCR nach der Pasteurisierung (d. h. vor der Abfüllung oder am Endprodukt) die QK-Manager bei einer Probe mit einem positiven „Treffer“ vor den Kopf stoßen.

Ob es sich um lebende Keime handelt, die die Pasteurisierung überlebt haben und somit ein Risiko für die Qualität des Endprodukts darstellen, oder ob es sich einfach um die Rest-DNS handelt, nachdem der Keim abgetötet wurde, der QK-Manager wird zwar auf ein vorher bestehendes Problem aufmerksam gemacht, dieses stellt aber für die Qualität des Biers während seiner Haltbarkeit keine Gefahr mehr dar.

In einigen Fällen schlägt der Hersteller der PCR „nach der Pasteurisierung“ einen Anreicherungsschritt von mindestens 24 Stunden vor der Analyse vor, damit, falls tote Zell-DNS vorhanden sein sollte, diese während der Anreicherung ausverdünnt wird und sich während der Anreicherung eindeutig nicht vermehrt. Das PCR-Ergebnis nach der Anreicherung hängt jedoch von der Höhe der Kontamination vor der Pasteurisierung und der Zeit ab, in der die freigesetzte DNS intakt bleibt. Dies hängt von vielen verschiedenen Biervariablen ab (z. B. pH-Wert, Temperatur ...). Sogenannte „falsch“-positive Ergebnisse sind immer noch möglich.

Ein anderer Ansatz besteht darin, die DNS einem Molekül auszusetzen (z. B. PMAxx ^TM - Biotium, Inc.), das eine hohe Affinität zur DNS hat und an diese anbindet, die lebensfähige Zelle aber nicht passieren kann, um vor der Amplifikation an die DNS im Inneren zu gelangen. Einmal gebunden und einer bestimmten Lichtwellenlänge ausgesetzt, kann die „fixierte“ DNS während der Amplifikation der PCR nicht mehr vervielfältigt werden. Wenn das beobachtete Endergebnis ein positiver „Treffer“ ist, wissen Sie, dass er von lebenden und lebensfähigen Zellen kommt!

• Die Polymerase Chain Reaction (PCR)-Technologie ist durch den Nachweis spezifischer DNS-Codesequenzen für die Bierkeime von Interesse sowohl sehr spezifisch als auch empfindlich 
• In den letzten 5 Jahren hat die PCR durch die Vereinfachung des Protokolls und die Senkung der Investitionskosten für die Geräte eine Demokratisierung erfahren.
• Heute wird die PCR als ein wirklich „produktionsorientiertes“ Werkzeug angesehen, da sie Ergebnisse am selben Tag liefern kann
• s gibt 2 Konzepte für die PCR-Technologie (1) Terminale PCR: Amplifikation des ausgewählten DNS-Segments für eine festgelegte Anzahl von Zyklen und anschließende Analyse des Ergebnisses (2) RT-PCR: während des Amplifikationsprozesses, Analyse in Echtzeit nach jedem Zyklus der vorhandenen DNS
• PCR ermöglicht je nach Plattform sowohl ein qualitatives als auch ein quantitatives Ergebnis
• Die QK von pasteurisierten Bieren mittels PCR erfordert einen zusätzlichen Schritt, um die Möglichkeit von „falsch-positiven“ Ergebnissen für die lebensfähigen Zellen zu vermeiden